高效液相色譜法測定白葡萄汁中苯甲酰脲類農藥

周建科，韓朝家，唐翠苓，付艷芳

(河北大學理化分析中心，河北省分析科學技術重點實驗室，河北 保定 071002)

苯甲酰脲類殺蟲劑是幾丁質合成抑制劑，通過抑制昆蟲表皮幾丁質的合成，殺滅害蟲。現已在糧食、蔬菜和水果種植上得到廣泛應用。但此類農藥的殘效期較長，其殘留對人體健康有害。美國、歐盟和日本等國家對該類農藥均制定了相應的最大殘留限量，我國國家標準中規定氟苯脲在柑橘中最大殘留限量為0.5mg/kg[1]，有關肉類[2]、蔬菜[3-5]、水果[5-7]和水[8-10]中該類農藥的殘留檢測已有報道，但果汁飲品(如白葡萄汁)中此類農藥的檢測報道很少。

目前，苯甲酰脲類農藥的檢測主要有固相萃取-液相色譜法[1,6]、基質固相分散-超高效液相色譜-串聯質譜法[4]、QuEChERS-液相色譜-電噴霧串聯質譜法[11]、液下單滴微萃取-高效液相色譜法[12]、微萃取瓶富集-液相色譜法[9]等。分散液液微萃取(dispersive liquid liquid microextraction，DLLME)技術于2006年由Assadi等[13]首次提出，具有操作簡單、快速、富集能力強、有機溶劑用量少等優點。本實驗采用該處理方法對白葡萄汁中4種苯甲酰脲類化合物進行提取、濃縮，結合正相高效液相色譜法，建立白葡萄汁中氟苯脲、殺鈴脲、除蟲脲、氟鈴脲4種苯甲酰脲類農藥的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

白葡萄汁 市售。

氟苯脲(98.8%)、殺鈴脲(99.5%)、除蟲脲(90%)、氟鈴脲(99.3%) 美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、二氯甲烷、無水乙醇和正己烷(均為色譜純)，所用水為二次蒸餾水，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

LC-6A高壓輸液泵 日本島津公司；7125型手動進樣閥 美國Rheodyne 公司；LINEAR 200紫外檢測器 美國熱電公司；XW-80A旋渦混合器 上海醫科大學儀器廠；N2000色譜工作站 浙江大學智能信息工程研究所。

1.3 方法

1.3.1 正相色譜分離條件

色譜柱：Apollo Silica柱(250mm×4.6mm，5μm)；流速：1.0mL/min；柱溫：室溫；檢測波長：200nm；進樣量：10.0μL；流動相：正己烷-無水乙醇(7：3，V/V)；采用色譜峰保留時間定性，外標法峰面積定量。

1.3.2 標準溶液配制

準確稱取氟苯脲、殺鈴脲、除蟲脲、氟鈴脲標準品適量，用甲醇溶解并定容，配成質量濃度均為1mg/mL的標準儲備液。移取標準儲備液各200μL于2mL的具塞錐形刻度管中，微氮氣流趕走甲醇，用流動相溶解并定容至2mL，制成標準混合液，4℃冰箱存放。用流動相逐級稀釋標準混合液，配制系列工作溶液。

1.3.3 樣品預處理

于10mL具塞尖底離心試管中，加入5.0mL樣品溶液(NaOH溶液調節pH值為3.7)。將225μL二氯甲烷和1.2mL甲醇混勻，用注射器迅速注入樣品溶液，形成乳濁液體系，靜置3min，以3500r/min離心3min，用250μL微量進樣器吸取離心管底部二氯甲烷相于具塞錐形刻度管中，微氮氣流吹至近干，用100μL流動相溶解，混勻。取10μL進樣分析。

2 結果與分析

2.1 色譜條件選擇

圖 1 標準品色譜圖Fig.1 Chromatogram of benzoylurea insecticide standards

實驗考察190～280nm范圍內4組分的紫外吸收情況，結果表明，在195～215nm范圍內有較強吸收，若采用反相色譜分離，常用的流動相溶劑在此波長范圍內往往有吸收，基線噪聲大，干擾測定。而正相色譜中正己烷等常用流動相則不會造成此種干擾，故本實驗選用正相色譜法。實驗證明，在200nm波長下靈敏度高且基線噪聲小，故選200nm作為最佳檢測波長。在等度洗脫條件下，考察不同體積比正己烷-無水乙醇作為流動相時出峰情況，當體積比為97：3時，4個組分能完全分離。標準品色譜圖見圖1。

2.2 萃取劑和分散劑選擇

萃取劑的性質是影響萃取效率的重要因素之一。萃取劑需滿足一定的條件：密度最好大于樣品溶液；易溶于分散劑不易溶于樣品溶液；富集效果好；不影響后續色譜分析。實驗考察二氯甲烷、三氯甲烷和氯苯對目標化合物的萃取情況，三氯甲烷和氯苯對組分出峰有干擾，二氯甲烷對目標化合物沒有干擾且萃取效果較好。

萃取劑體積對萃取效率有一定影響，在分散劑(甲醇)體積一定(1.2mL)的情況下，考察二氯甲烷100～300μL時，4種苯甲酰脲類化合物的萃取情況，結果見圖2。故選擇萃取劑體積是225μL。

圖 2 萃取劑體積對峰面積的影響Fig.2 Effect of extraction solvent volume on peak area

圖 3 分散劑體積對峰面積的影響Fig.3 Effect of dispersive solvent volume on peak area

分散液液微萃取中的分散劑要能夠很好的溶解樣品和萃取劑。實驗考察甲醇、乙醇、乙腈、丙酮、四氫呋喃作為分散劑時的情況。結果表明，乙醇和乙腈能很好的溶于樣品，但萃取效率較低；丙酮對目標化合物出峰有干擾；四氫呋喃不能很好的分散于樣品溶液中；甲醇既有好的溶解能力，又有高的萃取效率，故選甲醇做分散劑。

分散劑的體積是影響萃取效率的又一重要因素，體積過小，分散效果不好，導致萃取效率不高；體積過大，目標化合物會過多的溶解于樣品和分散劑中，同樣降低萃取效率。實驗考察分散劑體積0.8～1.4mL時的萃取情況，結果見圖3，選擇甲醇的體積是1.2mL。

2.3 萃取時間

在分散液液微萃取中，萃取時間是從向樣品溶液中加入萃取劑和分散劑混合溶液到開始離心的時間。實驗考察1～8min時的萃取情況，結果表明，萃取時間小于3min時，回收率略小于萃取時間為3min時；萃取時間大于3min時，回收率不再增加。故實驗選定萃取時間為3min。

2.4 酸度

酸度往往對萃取效果有影響。氟苯脲、殺鈴脲、除蟲脲、氟鈴脲在中性或弱酸性介質中穩定。所測樣品白葡萄汁本身的pH值為2.7，實驗考察pH值為2.7～5.6時，對4種待測物萃取效率的影響情況。結果表明，溶液pH值為3.7時，萃取效率最高，如圖4所示。

圖 4 pH值對峰面積的影響Fig.4 Effect of pH value on peak area

2.5 線性方程及檢出限

移取系列標準工作液，在所選的色譜條件下，以Y(峰面積)對X(質量濃度)繪制工作曲線，4組分在0.33～100μg/mL范圍內線性良好，其線性方程、相關系數及方法檢出限見表1。

表1 線性方程及方法檢出限Table 1 Linear equations and detection limits for insecticides

2.6 精密度

在最佳色譜條件下，將20μg/mL的混合標準溶液連續進樣6次，根據所得到的峰面積分別計算4個組分的精密度，氟苯脲、殺鈴脲、除蟲脲和氟鈴脲的RSD范圍在0.59%～1.74%之間，表明此方法的精密度良好。實驗結果見表2。

表2 方法的精密度實驗(n=6)Table 2 Results of precision experiments (n=6)

2.7 穩定性實驗

根據1.3.3節樣品預處理方法，配制樣品加標溶液。室溫下放置，分別于0、1、2、4、8、12h在優化的色譜條件下進行測定，結果見表3。計算4個組分的峰面積的RSD值在1.04%～1.78%范圍內，表明該方法在12h內有較好的穩定性。

表3 穩定性實驗結果Table 3 Stability of the method

2.8 加標回收率

表4 加標回收率及RSD(n=6)Table 4 Recoveries and RSD (n = 6) of benzoylurea insecticides

圖 5 樣品加標色譜圖Fig.5 Chromatogram of spiked sample

實驗考察兩個加標量條件下，氟苯脲、殺鈴脲、除蟲脲和氟鈴脲在白葡萄汁樣品中的加標回收率。每個加標樣品，均準確移取6份樣品溶液，按照優化的樣品處理方法和色譜條件，進行4個組分的含量分析。結果見表4。4組分的平均回收率范圍在73.2%～97.85%之間，RSD值在1.33%～4.62%范圍之間。說明方法重現性好，實驗結果可靠。樣品加標色譜圖見圖5。

2.9 樣品測定

在優化的色譜條件下，對市售白葡萄汁樣品進行測定，4組分未被檢出，樣品色譜圖見圖6。

圖 6 樣品色譜圖Fig.6 Chromatogram of real sample

3 結 論

本實驗建立了分散液液微萃取-正相色譜法同時測定白葡萄汁中氟苯脲、殺鈴脲、除蟲脲和氟鈴脲的方法。該方法操作簡單、快速、有機溶劑用量少，屬于環境友好的檢測方法。市售白葡萄汁中4組分均未檢出。

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