高效液相色譜法測(cè)定養(yǎng)殖環(huán)境中甲基睪丸酮?dú)埩袅?/h1>
2013-08-07 09:02:46鄧建朝李來(lái)好楊賢慶岑劍偉吳燕燕陳勝軍
食品科學(xué) 2013年10期 關(guān)鍵詞：檢測(cè)
鄧建朝，李來(lái)好，楊賢慶*，岑劍偉，吳燕燕，陳勝軍，戚 勃
(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300)
甲基睪丸酮(17α-methyltestosterone，17α-MeT)又名甲睪酮，甲基睪酮，甲基睪丸素。分子式為C20H30O2，相對(duì)分子質(zhì)量為302.45，不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，是一種人工合成的蛋白同化激素。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，甲基睪丸酮作為性別誘導(dǎo)制劑，魚(yú)苗期性別分化前投喂，可以誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)得到單雄性，顯著提高漁業(yè)產(chǎn)量[1-3]。作為一種激素，研究表明極小的殘留即能危害人體健康，如干擾人體內(nèi)激素的平衡，引起婦女出現(xiàn)類(lèi)似早孕的反應(yīng)及乳房脹、不規(guī)則出血等，影響肝臟功能，致新生兒畸形、溶血及黃疸等一系列副作用。鑒于甲基睪丸酮存在潛在的危害，包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家都將其列為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的禁用藥物。
目前甲基睪丸酮的檢測(cè)方法較多，主要有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)法[5-7]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)法[8-10]、毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，C E)法[11]、化學(xué)發(fā)光法[12]和高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法[13-15]。其中，酶聯(lián)免疫法作為一種生化檢測(cè)方法廣泛用于實(shí)際樣品檢測(cè)，其靈敏度高、特異性強(qiáng)、方便快捷，但存在假陽(yáng)性問(wèn)題；GC-MS法檢測(cè)限低，靈敏度高，但需將樣品經(jīng)過(guò)復(fù)雜的衍生化步驟后才能測(cè)定，導(dǎo)致前處理過(guò)程比較復(fù)雜，不適合大批量樣品的檢測(cè)；HPLC-MS法雖然靈敏度和特異性很高，但儀器昂貴，對(duì)操作人員要求較高，普及性較差；毛細(xì)管電泳法和化學(xué)發(fā)光法對(duì)操作人員要求較高，樣品前處理復(fù)雜，很難在實(shí)驗(yàn)室普及應(yīng)用。對(duì)于一些曾經(jīng)使用過(guò)甲基睪丸酮的池塘，長(zhǎng)時(shí)期殘留在水體及底泥中的藥物會(huì)對(duì)后續(xù)養(yǎng)殖的水產(chǎn)動(dòng)物造成二次污染，因此，有必要對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境中的甲基睪丸酮進(jìn)行監(jiān)測(cè)評(píng)估。而至今養(yǎng)殖水體及底泥環(huán)境中的基睪丸酮的檢測(cè)方法尚未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。本研究建立一套利用高效液相色譜檢測(cè)養(yǎng)殖池塘水體和底泥中甲基睪丸酮的方法，旨在為研究甲基睪丸酮代謝規(guī)律及監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖環(huán)境中甲基睪丸酮的殘留提供技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
實(shí)驗(yàn)材料采自中山市羅非魚(yú)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖魚(yú)池的水體和底泥。甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%) 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；甲醇(色譜純) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈、乙醚、二氯甲烷和冰乙酸等(均為分析純) 廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。
1.2 儀器與設(shè)備
1100高效液相色譜儀[配有二極管陣列檢測(cè)器(diode array detector，DAD)] 美國(guó)Agilent公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本Eyela公司；MMV-1000W萃取振蕩儀 日本東京理化器械株式會(huì)社；TDZ5-WS低速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；XW-80A微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠(chǎng)；GB204型電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司。
1.3 方法
1.3.1 色譜條件
色譜柱：Agilent C18柱(250mm×4.6mm(i.d.)，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.5%乙酸(77：23，V/V)；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：245nm。
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
200μg/mL甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0mg 甲基睪丸酮，用甲醇溶解，定容于50mL容量瓶中，于0～4℃避光存放；甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取適量甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，根據(jù)需要用甲醇配制成適當(dāng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
1.3.3 水體樣品前處理
先將水樣用0.45μm膜過(guò)濾，除去固體雜質(zhì)。準(zhǔn)確移取100mL水樣于250mL分液漏斗，加入30mL二氯甲烷，振搖5min，靜置，將二氯甲烷層移至100mL的梨形瓶。向分液漏斗再加入30mL二氯甲烷重復(fù)上述步驟一次，靜置分層后，將二氯甲烷層并入同一梨形瓶，于45℃條件下減壓蒸發(fā)至近干。殘留物用1.0mL甲醇溶解，取溶解液過(guò)0.45μm微孔濾膜，供液相色譜測(cè)定。
1.3.4 底泥樣品前處理
稱(chēng)取10.0g試樣于100mL聚丙烯離心管中，加入20mL甲醇，加塞劇烈振蕩提取10min，以4000r/min離心10min，將上清液移至雞心瓶中，向原離心管中加入20mL甲醇，重復(fù)上述步驟一次，合并提取液于梨形瓶中。在45℃水浴條件下減壓蒸發(fā)至近干，殘留物用1.0mL甲醇溶解，過(guò)0.45μm微孔濾膜，供液相色譜測(cè)定。
1.3.5 計(jì)算公式
水體中甲基睪丸酮的含量按公式(1)計(jì)算。
式中：cx為試樣中甲基睪丸酮含量/(μg/L)；cs為標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲基睪丸酮含量/(μg/mL)；A為試液峰面積響應(yīng)值；As為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積響應(yīng)值；V為試液定容體積/mL；V0為試樣體積/mL。
底泥中甲基睪丸酮的含量按公式(2)計(jì)算。
式中：cx為試樣中甲基睪丸酮含量/(μg/kg)；cs為標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲基睪丸酮含量/(μg/mL)；A為試液峰面積響應(yīng)值；V為試液定容體積/mL；As為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積響應(yīng)值；m為試樣質(zhì)量/g；W為含水率/%。
2 結(jié)果與分析
2.1 色譜條件的優(yōu)化
2.1.1 流動(dòng)相的選擇
流動(dòng)相優(yōu)化過(guò)程中，以甲醇為有機(jī)相，分別選擇水、0.5%乙酸溶液、50mmol/L乙酸銨溶液(pH4.5)作為水相，比較分離效果。結(jié)果表明，水相為0.5%乙酸和50mmol/L乙酸銨(pH4.5)時(shí)，能夠減少峰形拖尾，鑒于鹽溶液會(huì)影響分離柱的使用壽命，本實(shí)驗(yàn)選用0.5%的乙酸作為水相。由于底泥樣品中成分復(fù)雜，甲醇提取液中雜質(zhì)較多，如果甲醇在流動(dòng)相中所占體積過(guò)大，樣品中雜質(zhì)峰對(duì)目標(biāo)物干擾嚴(yán)重，綜合考慮，采用甲醇-0.5%乙酸體積比為77：23時(shí)，峰型較好，目標(biāo)峰和雜質(zhì)峰能夠完全分離。
2.1.2 取樣量和進(jìn)樣量的選擇
由于甲基睪丸酮在水體中殘留較少，試樣提取時(shí)，取樣量過(guò)小則不利于監(jiān)控，取樣量過(guò)大又造成操作上的困難，最后取樣量選擇100mL。底泥本身含雜質(zhì)成分較多，取樣量過(guò)大，雜質(zhì)的干擾變大，最后選擇10g作為土樣的取樣量。由于提高色譜進(jìn)樣量可以降低實(shí)際樣品檢測(cè)限，比較了進(jìn)樣量為10、20、30、40μL和50μL條件下甲基睪丸酮的分離情況。結(jié)果表明，隨著進(jìn)樣量的增大，目標(biāo)峰的峰寬變寬，峰高變低，加大了樣品中雜質(zhì)的干擾。進(jìn)樣量太小，不利于實(shí)際試樣的測(cè)定，綜合考慮以上因素，進(jìn)樣量選用20μL。
2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇
圖 1 甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of 17α-Met standard solution
圖 2 水體中甲基睪丸酮加標(biāo)色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank water with and without spiked 17α-MeT (5 μg/L)
圖 3 底泥中甲基睪丸酮加標(biāo)色譜圖Fig.3 Chromatograms of blank sediment with and without spiked 17α-MeT (5 μg/L)
取某一濃度甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品，用液相自帶光電二極管陣列檢測(cè)器從190～400nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示甲基睪丸酮的最大吸收波長(zhǎng)在245nm處。因此，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇245nm。
在優(yōu)化的色譜條件下，甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品典型色譜圖見(jiàn)圖1，相對(duì)保留時(shí)間約為7.9min，峰形尖銳，對(duì)稱(chēng)。加標(biāo)池塘水體和底泥色譜圖見(jiàn)圖2、3。
2.2 提取溶劑的選擇
根據(jù)甲基睪丸酮的性質(zhì)及環(huán)境樣品的特點(diǎn)，水體中的甲基睪丸酮?dú)埩艨梢酝ㄟ^(guò)二氯甲烷進(jìn)行液-液萃取。底泥中的甲基睪丸酮分別采用甲醇、乙腈、乙醚、二氯甲烷等作為提取溶劑進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。當(dāng)?shù)啄嗉訕?biāo)質(zhì)量濃度為50.0μg/kg時(shí)，甲醇、乙腈、乙醚作為提取溶劑對(duì)底泥中甲基睪丸的提取率分別為97.6%、101%和93.7%。結(jié)果表明，除二氯甲烷，幾種有機(jī)溶劑對(duì)甲基睪丸酮的提取率均較高。二氯甲烷可使底泥嚴(yán)重變性，凝成一團(tuán)，將底泥中有機(jī)膠體(腐殖質(zhì))中的雜質(zhì)提取出來(lái)，懸浮于溶液中，給后期處理和測(cè)定造成很大麻煩。底泥本身含有一定量水，采用乙醚提取后，經(jīng)過(guò)離心，乙醚和水相分層，也增加了后期處理的難度。相比之下，甲醇和乙腈的提取效果最好，從環(huán)保和經(jīng)濟(jì)性考慮，最后選用甲醇作為提取溶劑。
2.3 線(xiàn)性關(guān)系與檢測(cè)限
用甲醇配制質(zhì)量濃度依次為0.0500、0.100、0.500、1.00、10.0μg/mL和50.0μg/mL的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其峰面積相應(yīng)值，以峰面積對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度做工作曲線(xiàn)。當(dāng)進(jìn)樣量為20μL時(shí)，甲基睪丸酮在質(zhì)量濃度為0.0500～50.0μg/mL的范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為Y=43.61X－0.3601，r=0.9999；在本法測(cè)定條件下，按信噪比RSN=3所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為依據(jù)計(jì)算檢出限，水體中甲基睪丸酮的檢測(cè)限為0.5μg/L，底泥中甲基睪丸酮的檢測(cè)限5.0μg/kg。
2.4 回收率與精密度
表1 水體加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 1 Recovery rates and relative standard deviations of 17α-MeT in spiked water at three levels (n=5)
將已知質(zhì)量濃度的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液加入所采集水體和底泥中，使水體加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為1.00、5.00、25.0μg/L，每個(gè)平行設(shè)一個(gè)空白對(duì)照，每個(gè)質(zhì)量濃度做5個(gè)平行樣品；使底泥加標(biāo)量為10.0、50.0、250μg/kg，每個(gè)平行設(shè)一個(gè)空白對(duì)照，每個(gè)質(zhì)量濃度做5個(gè)平行樣品。加標(biāo)后充分混勻，靜置30min，按1.3.3節(jié)進(jìn)行樣品前處理，計(jì)算回收率和精密度。
表2 底泥加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 2 Recovery rates and relative standard deviations of 17α-MeT in spiked sediment at three levels (n=5)
由表1、2 可見(jiàn)，水體中方法的加標(biāo)回收率在93.3%～101%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～5.5%；底泥中方法的加標(biāo)回收率在88.7%～96.6%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%～6.2%，說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。
3 結(jié) 論
本實(shí)驗(yàn)建立的養(yǎng)殖環(huán)境水體和底泥中甲基睪丸酮?dú)埩舾咝б合嗌V測(cè)定方法中，甲基睪丸酮在水體和底泥中檢測(cè)限分別為0.5μg/L和5.0μg/kg。在本實(shí)驗(yàn)條件下，被測(cè)樣品的各組分與樣品基質(zhì)均實(shí)現(xiàn)較好分離，出峰時(shí)間合適，檢測(cè)靈敏度較高。結(jié)果表明，采用本方法測(cè)定養(yǎng)殖水體和底泥中的甲基睪丸酮，操作簡(jiǎn)便、快速，適合于大批量樣品的處理和檢測(cè)，準(zhǔn)確度和精密度較高，并具有很高的可靠性和實(shí)用性，適合在養(yǎng)殖環(huán)境監(jiān)測(cè)中推廣使用。
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(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家水產(chǎn)品加工技術(shù)研發(fā)中心，廣東 廣州 510300)
甲基睪丸酮(17α-methyltestosterone，17α-MeT)又名甲睪酮，甲基睪酮，甲基睪丸素。分子式為C20H30O2，相對(duì)分子質(zhì)量為302.45，不溶于水，易溶于有機(jī)溶劑，是一種人工合成的蛋白同化激素。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，甲基睪丸酮作為性別誘導(dǎo)制劑，魚(yú)苗期性別分化前投喂，可以誘導(dǎo)性逆轉(zhuǎn)得到單雄性，顯著提高漁業(yè)產(chǎn)量[1-3]。作為一種激素，研究表明極小的殘留即能危害人體健康，如干擾人體內(nèi)激素的平衡，引起婦女出現(xiàn)類(lèi)似早孕的反應(yīng)及乳房脹、不規(guī)則出血等，影響肝臟功能，致新生兒畸形、溶血及黃疸等一系列副作用。鑒于甲基睪丸酮存在潛在的危害，包括我國(guó)在內(nèi)的許多國(guó)家都將其列為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的禁用藥物。
目前甲基睪丸酮的檢測(cè)方法較多，主要有酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)法[4]、氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)法[5-7]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS)法[8-10]、毛細(xì)管電泳(capillary electrophoresis，C E)法[11]、化學(xué)發(fā)光法[12]和高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)法[13-15]。其中，酶聯(lián)免疫法作為一種生化檢測(cè)方法廣泛用于實(shí)際樣品檢測(cè)，其靈敏度高、特異性強(qiáng)、方便快捷，但存在假陽(yáng)性問(wèn)題；GC-MS法檢測(cè)限低，靈敏度高，但需將樣品經(jīng)過(guò)復(fù)雜的衍生化步驟后才能測(cè)定，導(dǎo)致前處理過(guò)程比較復(fù)雜，不適合大批量樣品的檢測(cè)；HPLC-MS法雖然靈敏度和特異性很高，但儀器昂貴，對(duì)操作人員要求較高，普及性較差；毛細(xì)管電泳法和化學(xué)發(fā)光法對(duì)操作人員要求較高，樣品前處理復(fù)雜，很難在實(shí)驗(yàn)室普及應(yīng)用。對(duì)于一些曾經(jīng)使用過(guò)甲基睪丸酮的池塘，長(zhǎng)時(shí)期殘留在水體及底泥中的藥物會(huì)對(duì)后續(xù)養(yǎng)殖的水產(chǎn)動(dòng)物造成二次污染，因此，有必要對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境中的甲基睪丸酮進(jìn)行監(jiān)測(cè)評(píng)估。而至今養(yǎng)殖水體及底泥環(huán)境中的基睪丸酮的檢測(cè)方法尚未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道。本研究建立一套利用高效液相色譜檢測(cè)養(yǎng)殖池塘水體和底泥中甲基睪丸酮的方法，旨在為研究甲基睪丸酮代謝規(guī)律及監(jiān)測(cè)養(yǎng)殖環(huán)境中甲基睪丸酮的殘留提供技術(shù)支持。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
實(shí)驗(yàn)材料采自中山市羅非魚(yú)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)養(yǎng)殖魚(yú)池的水體和底泥。甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%) 德國(guó)Dr.Ehrenstorfer GmbH 公司；甲醇(色譜純) 美國(guó)Sigma-Aldrich公司；甲醇、乙腈、乙醚、二氯甲烷和冰乙酸等(均為分析純) 廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。
1.2 儀器與設(shè)備
1100高效液相色譜儀[配有二極管陣列檢測(cè)器(diode array detector，DAD)] 美國(guó)Agilent公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本Eyela公司；MMV-1000W萃取振蕩儀 日本東京理化器械株式會(huì)社；TDZ5-WS低速離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司；XW-80A微型旋渦混合儀 上海滬西分析儀器廠(chǎng)；GB204型電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司。
1.3 方法
1.3.1 色譜條件
色譜柱：Agilent C18柱(250mm×4.6mm(i.d.)，5μm)；流動(dòng)相：甲醇-0.5%乙酸(77：23，V/V)；流速：1.0mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：245nm。
1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
200μg/mL甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱(chēng)取10.0mg 甲基睪丸酮，用甲醇溶解，定容于50mL容量瓶中，于0～4℃避光存放；甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)工作液：準(zhǔn)確吸取適量甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，根據(jù)需要用甲醇配制成適當(dāng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
1.3.3 水體樣品前處理
先將水樣用0.45μm膜過(guò)濾，除去固體雜質(zhì)。準(zhǔn)確移取100mL水樣于250mL分液漏斗，加入30mL二氯甲烷，振搖5min，靜置，將二氯甲烷層移至100mL的梨形瓶。向分液漏斗再加入30mL二氯甲烷重復(fù)上述步驟一次，靜置分層后，將二氯甲烷層并入同一梨形瓶，于45℃條件下減壓蒸發(fā)至近干。殘留物用1.0mL甲醇溶解，取溶解液過(guò)0.45μm微孔濾膜，供液相色譜測(cè)定。
1.3.4 底泥樣品前處理
稱(chēng)取10.0g試樣于100mL聚丙烯離心管中，加入20mL甲醇，加塞劇烈振蕩提取10min，以4000r/min離心10min，將上清液移至雞心瓶中，向原離心管中加入20mL甲醇，重復(fù)上述步驟一次，合并提取液于梨形瓶中。在45℃水浴條件下減壓蒸發(fā)至近干，殘留物用1.0mL甲醇溶解，過(guò)0.45μm微孔濾膜，供液相色譜測(cè)定。
1.3.5 計(jì)算公式
水體中甲基睪丸酮的含量按公式(1)計(jì)算。
式中：cx為試樣中甲基睪丸酮含量/(μg/L)；cs為標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲基睪丸酮含量/(μg/mL)；A為試液峰面積響應(yīng)值；As為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積響應(yīng)值；V為試液定容體積/mL；V0為試樣體積/mL。
底泥中甲基睪丸酮的含量按公式(2)計(jì)算。
式中：cx為試樣中甲基睪丸酮含量/(μg/kg)；cs為標(biāo)準(zhǔn)溶液中甲基睪丸酮含量/(μg/mL)；A為試液峰面積響應(yīng)值；V為試液定容體積/mL；As為標(biāo)準(zhǔn)溶液峰面積響應(yīng)值；m為試樣質(zhì)量/g；W為含水率/%。
2 結(jié)果與分析
2.1 色譜條件的優(yōu)化
2.1.1 流動(dòng)相的選擇
流動(dòng)相優(yōu)化過(guò)程中，以甲醇為有機(jī)相，分別選擇水、0.5%乙酸溶液、50mmol/L乙酸銨溶液(pH4.5)作為水相，比較分離效果。結(jié)果表明，水相為0.5%乙酸和50mmol/L乙酸銨(pH4.5)時(shí)，能夠減少峰形拖尾，鑒于鹽溶液會(huì)影響分離柱的使用壽命，本實(shí)驗(yàn)選用0.5%的乙酸作為水相。由于底泥樣品中成分復(fù)雜，甲醇提取液中雜質(zhì)較多，如果甲醇在流動(dòng)相中所占體積過(guò)大，樣品中雜質(zhì)峰對(duì)目標(biāo)物干擾嚴(yán)重，綜合考慮，采用甲醇-0.5%乙酸體積比為77：23時(shí)，峰型較好，目標(biāo)峰和雜質(zhì)峰能夠完全分離。
2.1.2 取樣量和進(jìn)樣量的選擇
由于甲基睪丸酮在水體中殘留較少，試樣提取時(shí)，取樣量過(guò)小則不利于監(jiān)控，取樣量過(guò)大又造成操作上的困難，最后取樣量選擇100mL。底泥本身含雜質(zhì)成分較多，取樣量過(guò)大，雜質(zhì)的干擾變大，最后選擇10g作為土樣的取樣量。由于提高色譜進(jìn)樣量可以降低實(shí)際樣品檢測(cè)限，比較了進(jìn)樣量為10、20、30、40μL和50μL條件下甲基睪丸酮的分離情況。結(jié)果表明，隨著進(jìn)樣量的增大，目標(biāo)峰的峰寬變寬，峰高變低，加大了樣品中雜質(zhì)的干擾。進(jìn)樣量太小，不利于實(shí)際試樣的測(cè)定，綜合考慮以上因素，進(jìn)樣量選用20μL。
2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇
圖 1 甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of 17α-Met standard solution
圖 2 水體中甲基睪丸酮加標(biāo)色譜圖Fig.2 Chromatograms of blank water with and without spiked 17α-MeT (5 μg/L)
圖 3 底泥中甲基睪丸酮加標(biāo)色譜圖Fig.3 Chromatograms of blank sediment with and without spiked 17α-MeT (5 μg/L)
取某一濃度甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品，用液相自帶光電二極管陣列檢測(cè)器從190～400nm波長(zhǎng)處進(jìn)行掃描，結(jié)果顯示甲基睪丸酮的最大吸收波長(zhǎng)在245nm處。因此，檢測(cè)波長(zhǎng)選擇245nm。
在優(yōu)化的色譜條件下，甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)品典型色譜圖見(jiàn)圖1，相對(duì)保留時(shí)間約為7.9min，峰形尖銳，對(duì)稱(chēng)。加標(biāo)池塘水體和底泥色譜圖見(jiàn)圖2、3。
2.2 提取溶劑的選擇
根據(jù)甲基睪丸酮的性質(zhì)及環(huán)境樣品的特點(diǎn)，水體中的甲基睪丸酮?dú)埩艨梢酝ㄟ^(guò)二氯甲烷進(jìn)行液-液萃取。底泥中的甲基睪丸酮分別采用甲醇、乙腈、乙醚、二氯甲烷等作為提取溶劑進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。當(dāng)?shù)啄嗉訕?biāo)質(zhì)量濃度為50.0μg/kg時(shí)，甲醇、乙腈、乙醚作為提取溶劑對(duì)底泥中甲基睪丸的提取率分別為97.6%、101%和93.7%。結(jié)果表明，除二氯甲烷，幾種有機(jī)溶劑對(duì)甲基睪丸酮的提取率均較高。二氯甲烷可使底泥嚴(yán)重變性，凝成一團(tuán)，將底泥中有機(jī)膠體(腐殖質(zhì))中的雜質(zhì)提取出來(lái)，懸浮于溶液中，給后期處理和測(cè)定造成很大麻煩。底泥本身含有一定量水，采用乙醚提取后，經(jīng)過(guò)離心，乙醚和水相分層，也增加了后期處理的難度。相比之下，甲醇和乙腈的提取效果最好，從環(huán)保和經(jīng)濟(jì)性考慮，最后選用甲醇作為提取溶劑。
2.3 線(xiàn)性關(guān)系與檢測(cè)限
用甲醇配制質(zhì)量濃度依次為0.0500、0.100、0.500、1.00、10.0μg/mL和50.0μg/mL的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定其峰面積相應(yīng)值，以峰面積對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度做工作曲線(xiàn)。當(dāng)進(jìn)樣量為20μL時(shí)，甲基睪丸酮在質(zhì)量濃度為0.0500～50.0μg/mL的范圍內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為Y=43.61X－0.3601，r=0.9999；在本法測(cè)定條件下，按信噪比RSN=3所對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度為依據(jù)計(jì)算檢出限，水體中甲基睪丸酮的檢測(cè)限為0.5μg/L，底泥中甲基睪丸酮的檢測(cè)限5.0μg/kg。
2.4 回收率與精密度
表1 水體加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 1 Recovery rates and relative standard deviations of 17α-MeT in spiked water at three levels (n=5)
將已知質(zhì)量濃度的甲基睪丸酮標(biāo)準(zhǔn)溶液加入所采集水體和底泥中，使水體加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為1.00、5.00、25.0μg/L，每個(gè)平行設(shè)一個(gè)空白對(duì)照，每個(gè)質(zhì)量濃度做5個(gè)平行樣品；使底泥加標(biāo)量為10.0、50.0、250μg/kg，每個(gè)平行設(shè)一個(gè)空白對(duì)照，每個(gè)質(zhì)量濃度做5個(gè)平行樣品。加標(biāo)后充分混勻，靜置30min，按1.3.3節(jié)進(jìn)行樣品前處理，計(jì)算回收率和精密度。
表2 底泥加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=5)Table 2 Recovery rates and relative standard deviations of 17α-MeT in spiked sediment at three levels (n=5)
由表1、2 可見(jiàn)，水體中方法的加標(biāo)回收率在93.3%～101%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.0%～5.5%；底泥中方法的加標(biāo)回收率在88.7%～96.6%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.7%～6.2%，說(shuō)明方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。
3 結(jié) 論
本實(shí)驗(yàn)建立的養(yǎng)殖環(huán)境水體和底泥中甲基睪丸酮?dú)埩舾咝б合嗌V測(cè)定方法中，甲基睪丸酮在水體和底泥中檢測(cè)限分別為0.5μg/L和5.0μg/kg。在本實(shí)驗(yàn)條件下，被測(cè)樣品的各組分與樣品基質(zhì)均實(shí)現(xiàn)較好分離，出峰時(shí)間合適，檢測(cè)靈敏度較高。結(jié)果表明，采用本方法測(cè)定養(yǎng)殖水體和底泥中的甲基睪丸酮，操作簡(jiǎn)便、快速，適合于大批量樣品的處理和檢測(cè)，準(zhǔn)確度和精密度較高，并具有很高的可靠性和實(shí)用性，適合在養(yǎng)殖環(huán)境監(jiān)測(cè)中推廣使用。
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