液相色譜法同時測定火鍋底料中11種氨基甲酸酯類農藥殘留

唐柏彬，郗存顯，鄒 蕓，王國民，李賢良，張 雷，陳冬東，張進忠*

(1.西南大學資源環境學院，三峽庫區生態環境教育部重點實驗室，重慶 400715；2.重慶出入境檢驗檢疫局，重慶市進出口食品安全工程技術研究中心，重慶 400020；3. 重慶市市政環衛監測中心，重慶 401121；4.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123)

氨基甲酸酯類農藥具有高效、高選擇性、分解快和殘留低等特點，被廣泛用于蔬菜、水果和糧食等農作物的殺蟲、殺螨和除草等活動[1]。但是，過量使用氨基甲酸酯類農藥會造成其在植物體內殘留，再通過食物鏈進入人體，引起急性中毒，并嚴重危害人體健康?；疱伒琢鲜怯膳Ｓ?、辣椒、花椒、蔥、姜、蒜和香辛料等幾十種原料混合熬制而成的復合調味料，其植物源性原料在生產過程中可能會引入氨基甲酸酯類農藥。因此，建立火鍋底料中氨基甲酸酯類農藥殘留的測定方法具有十分重要的意義。

目前，食品中氨基甲酸酯類農藥的測定方法主要有氣相色譜法[2]、氣相色譜-質譜法[3]、液相色譜法[4-9]和液相色譜-質譜法[10-12]等。其中，液相色譜柱后衍生-熒光檢測法具有靈敏度高、測定成本低廉的特點，在測定強極性、熱穩定性差的化合物時表現出獨特的優勢，已應用于蔬菜和水果[4-7]、糧食[8]及水產品[9]等簡單基質中氨基甲酸酯類農藥的測定，對于火鍋底料這種既含有動物源性原料又含有植物源性原料的復雜基質，則要求采用更為有效的提取、分離和凈化技術。目前尚未見到火鍋底料中氨基甲酸酯類農藥殘留檢測研究的報道。為此，本研究采用層析硅膠基質分散和乙腈提取火鍋底料中的氨基甲酸酯類農藥，凝膠滲透色譜(gel-permeation chromatograph，GPC)和氨基固相萃取柱凈化，液相色譜柱后衍生-熒光檢測法同時測定火鍋底料中的11種氨基甲酸酯類農藥，以期為火鍋底料的質量監控提供有效的技術手段。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

涕滅威(aldicarb，99.0%)、涕滅威砜(aldicarb sulfone，95.0%)、涕滅威亞砜(aldicarb sulfoxide，9 5.5%)、滅多威(methomyl，9 8.5%)、惡蟲威(bendiocarb，98.5%)、呋喃丹(carbofuran，99.0%)、3-羥基呋喃丹(3-hydroxy-carbofuran，99.5%)、甲萘威(carbaryl，97.0%)、硫雙威(thiodicarb，95.0%)、仲丁威(fenobucarb，95.5%)和甲硫威(methiocarb，99.5%)標準品 德國Dr. Ehrenstorfer公司；甲醇、乙腈和二氯甲烷(HPLC級) 美國Tedia公司；乙酸乙酯、環己烷(分析純) 重慶川東化工有限公司；鄰苯二甲醛(OPA)和巰基乙醇(Thiofluor) 美國Pickering公司；層析硅膠(75～150μm) 青島海洋化工廠。

水解液：0.4% NaOH溶液(Cat. No CB130)；OPA稀釋液：0.4%硼砂溶液(Cat. No CB910)；試液Ⅰ：稱取0.10g OPA，溶于10mL甲醇；試液Ⅱ：稱取2.0g巰基乙醇，溶于20mL OPA稀釋液；OPA衍生試劑：將試液Ⅰ和Ⅱ依次加入到930mL的OPA稀釋液中，混勻，充氮30min備用。

Ultimate 3000型液相色譜儀(配RFC 3000熒光檢測器) 美國戴安公司；Pinnacle PCX型柱后衍生儀 美國Pickering公司；凝膠滲透色譜凈化儀(配400mm×25mm (i.d.)凈化柱，內裝S-X3 Bio-Beads(38～75μm)填料) 美國J2 Scientific公司；氨基固相萃取柱(500mg/3mL) 美國Supelco公司；3-30K型冷凍離心機 德國Sigma公司；旋轉蒸發儀 德國Heidolph公司。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液的制備

氨基甲酸酯農藥標準儲備液：分別準確稱取適量涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、滅多威、惡蟲威、呋喃丹、3-羥基呋喃丹、甲萘威、硫雙威、仲丁威和甲硫威標準品，用甲醇配制成質量濃度100μg/mL的單一標準貯備液，儲存于棕色試劑瓶中，在4℃冰箱中避光保存。

氨基甲酸酯農藥混合標準溶液(1μg/mL)：分別移取1.00mL涕滅威、涕滅威砜、涕滅威亞砜、滅多威、惡蟲威、呋喃丹、3-羥基呋喃丹、甲萘威、硫雙威、仲丁威和甲硫威標準貯備液于100mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容，儲存于棕色試劑瓶中，在4℃冰箱中避光保存。根據需要，用15%甲醇溶液配制成相應質量濃度的標準工作溶液。

1.2.2 樣品提取

準確稱取5.00g混合均勻的火鍋底料樣品于研缽中，加入約4g層析硅膠，研磨混勻后轉移至50mL離心管中。用30mL乙腈分3次洗滌研缽，合并洗滌液于離心管中，渦旋混合提取2min，于5000r/min冷凍離心10min，將上清液轉移至150mL旋蒸瓶中，再加入30mL乙腈提取一次，合并提取液，于40℃條件下旋蒸濃縮至干，用10mL乙酸乙酯-環己烷(1：1，V/V)溶解殘渣，過0.45μm微孔濾膜待凈化。

1.2.3 樣品凈化

GPC凈化：將5.0mL待凈化液轉移至GPC凈化柱，以乙酸乙酯-環己烷(1：1，V/V)作流動相，流速4.7mL/min，收集11～18min的流出液。將流出液轉移至50mL旋蒸瓶中，40℃旋蒸濃縮至干，用2mL甲醇-二氯甲烷(1：99，V/V)溶解殘渣，待SPE柱再凈化。

SPE柱凈化：將GPC凈化后的樣品溶液轉移至經3mL甲醇-二氯甲烷(1：99，V/V)活化后的氨基固相萃取柱中，用2mL甲醇-二氯甲烷(1：99，V/V)洗滌旋蒸瓶，洗滌液轉移至SPE柱中，再用4mL甲醇-二氯甲烷(1：99，V/V)淋洗，收集全部流出液，40℃氮氣吹干，用1mL 15%甲醇溶液溶解殘渣，過0.45μm微孔濾膜后進行液相色譜測定。

1.2.4 液相色譜條件

色譜柱：Agilent Zorbax XDB-C18液相色譜柱(150mm×4.6mm，3.5μm)；柱溫：42℃；進樣量：20μL；流動相：甲醇-水，流速1.0mL/min，梯度洗脫程序見表1；熒光檢測器的激發波長330nm，發射波長465nm。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

1.2.5 柱后衍生條件

0.4% NaOH溶液和OPA衍生試劑，流速均為0.3mL/min；反應器和水解溫度均為100℃；衍生化溫度為室溫。

2 結果與分析

2.1 提取條件的優化

2.1.1 提取方式的選擇

火鍋底料中油脂含量高達30%～80%，其中的牛油在常溫時為凝固狀態，熔點在43℃以上[13]，提取溶劑很難浸透到油脂內部。比較振蕩、超聲、均質和層析硅膠分散等方式的提取效果，發現振蕩和超聲提取時樣品與提取液接觸不充分；均質提取時樣品能充分分散，但有部分樣品黏附在均質器上，影響回收率；層析硅膠分散提取時，溶劑和樣品可充分接觸，提取效率高，回收率均在70%以上，因此選擇層析硅膠分散作為提取方式。

2.1.2 提取溶劑的選擇

目前，大多采用甲醇[14]、乙腈[3-6,9]、丙酮[2]、乙酸乙酯[15]和二氯甲烷[8]等作為植物源性樣品、水產品[9]和脂肪[16]中氨基甲酸酯類農藥的提取溶劑。甲醇和乙腈溶解油脂的能力比丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷弱。本研究比較了甲醇和乙腈的提取效果，結果表明甲醇的提取回收率在65%～100%，其中涕滅威亞砜、滅多威、涕滅威、呋喃丹、甲萘威和仲丁威6種農藥的回收率大于80%；乙腈的提取回收率在75%～98%，其中涕滅威亞砜，涕滅威砜、滅多威、涕滅威、惡蟲威、呋喃丹、甲萘威和仲丁威8種農藥的回收率大于80%，與檢測水產品[9]中涕滅威、呋喃丹和甲萘威的回收率相當，比檢測脂肪[16]中甲萘威等農藥殘留的回收率高。由于乙腈對目標化合物的提取效率較高，且提取油脂量較甲醇少，有利于進一步凈化，因此本研究選擇乙腈作為提取溶劑。

2.2 凈化條件的選擇

在測定蔬菜和水果中的氨基甲酸酯類農藥時，通常采用液-液萃取[14]、N-丙基乙二胺(N-propylethylenediamine，PSA)分散固相萃取[6]和SPE[4-5,10]等凈化方式，GPC[16-17]主要用于動物源性樣品的凈化。單獨采用液-液萃取、PSA和SPE凈化提取液后，發現凈化液中仍有大量色素和油脂；單獨采用GPC凈化雖能有效去除油脂和色素，但不能完全去除提取液中的小分子雜質。因此，比較了GPC分別與液-液萃取凈化、PSA、中性氧化鋁柱和氨基固相萃取柱結合對空白樣品的凈化效果，結果如圖1所示。

圖 1 不同凈化方法的凈化效果Fig.1 Purification efficiency of different cleanup methods

從圖1可以看出，GPC結合氨基柱的凈化效果最佳，在目標峰附近無明顯干擾，樣品的加標回收率良好，涕滅威、涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威砜、惡蟲威、呋喃丹、3-羥基呋喃丹、甲萘威、硫雙威、仲丁威和甲硫威的加標回收率分別為84.6%～99.8%、72.9%～93.5%、75.8%～96.6%、86.5%～101.5%、71.1%～95.2%、72.5%～96.9%、72.8%～94.7%、74.6%～91.2%、70.3%～91.0%、73.5%～90.8%和70.6%～93.4%，能夠滿足農藥殘留分析的要求。因此，本研究在GPC凈化后再用氨基柱對樣品進行凈化。

2.3 液相色譜條件的優化

2.3.1 色譜條件的選擇

圖 2 不同色譜柱的分離效果Fig.2 Separation effects of different chromatographic columns

在檢測氨基甲酸酯類農藥時，大多采用填料粒徑為5μm的C18柱[4-7]作分離柱，以甲醇-水[4-5,7]和乙腈-水[6]體系梯度洗脫分離。由于惡蟲威和呋喃丹結構相似，采用5μm填料的色譜柱無法將二者有效分離。以甲醇-水為流動相，比較了3種規格的色譜柱的分離效果(圖2)。從圖2可以看出，Zorbax XDB-C18柱(150mm×4.6mm，3.5μm)粒徑小，理論塔板數高，對惡蟲威和呋喃丹的分離效果優于5μm填料的兩種色譜柱，其他9種氨基甲酸酯類農藥的分離度(R)均超過1.5。同時，還比較了甲醇-水和乙腈-水體系梯度洗脫的分離效果，發現兩種體系均能有效分離惡蟲威和呋喃丹，但甲醇-水體系所需分離時間較乙腈-水體系少20%，即在38min內能完成分離。因此，本研究采用Zorbax XDB-C18柱(150mm×4.6mm，3.5μm)作為分離柱，以甲醇-水體系梯度洗脫。

2.3.2 定容溶劑的選擇

目前，大多采用甲醇[4-5,9]為定容溶劑，有研究表明樣液中高濃度的甲醇或乙腈會增加待測物色譜峰形的不對稱性[6]。因此，本實驗比較了不同比例的甲醇-水定容時對待測物峰形的影響，結果如圖3所示。

圖 3 定容溶劑對色譜峰形的影響Fig.3 Effect of solvent on chromatographic peak shape

從圖3可以看出，當甲醇含量低于50%時能獲得良好的峰形。本研究采用15%的甲醇-水(V/V)為定容溶劑，與梯度洗脫流動相的起始比例保持一致。

2.4 方法評價

2.4.1 線性范圍和檢測限

在選定的色譜條件下，測定不同質量濃度的氨基甲酸酯類農藥標準溶液的峰面積，并獲得11種農藥的檢測限和定量限，見表2。

表2 11種氨基甲酸酯類農藥的保留時間、線性范圍、回歸方程和檢測限Table 2 Retention time, linear ranges, calibration equations and LODs of 11 carbamate pesticide residues

從表2可以看出，在質量濃度0.01～0.50mg/L范圍內，氨基甲酸酯類農藥的峰面積與其質量濃度間的線性關系良好，相關系數均在0.999以上；火鍋底料中11種氨基甲酸酯類農藥的檢測限(RSN=3)為0.3～1.2μg/kg，定量限(RSN=10)均為10μg/kg，較現有研究[4-10]中涕滅威亞砜、涕滅威砜、滅多威、3-羥基呋喃丹、涕滅威、呋喃丹、甲萘威和仲丁威的檢測限低2～10倍。

2.4.2 加標回收率和精密度

圖 4 空白和加標樣品的色譜圖Fig.4 Chromatograms of blank hotpot condiments with and without spiked standards

表3 添加回收率和精密度(n = 6)Table 3 Recovery rates and precision of 11 carbamate pesticide residues in hotpot condiments (n = 6)

從表3可以看出，11種氨基甲酸酯類農藥的平均回收率為76.2%～95.5%，相對標準偏差為3.4%～11.9%(n = 6)，比現有報道動物源性食品中涕滅威、呋喃丹和甲萘威的回收率高[9,15-16]，能夠滿足多種農藥殘留檢測的要求。空白和加標樣品的色譜圖見圖4。

2.5 實際樣品分析

隨機抽取市售的6批火鍋底料樣品進行檢測，在1批樣品中發現甲萘威和仲丁威農藥殘留，檢出量均低于0.01mg/kg，其他農藥均未檢出。

3 結 論

采用層析硅膠基質分散、乙腈提取、GPC結合氨基固相萃取柱凈化樣品，建立了液相色譜柱后衍生熒光檢測火鍋底料中11種氨基甲酸酯類農藥的方法。本方法能有效地去除樣品基質的干擾，獲得了滿意的分離效果和檢測靈敏度，加標回收率和檢測限均滿足農藥殘留分析的要求，可應用于火鍋底料中多種氨基甲酸酯類農藥殘留的檢測。

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