李斯特屬細菌特征揮發性代謝物的鑒定分析

陳 雪，倪 鵬，喻勇新，潘迎捷，趙 勇,*

(1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.上海水產品加工及貯藏工程技術研究中心，上海 201306；3.南通出入境檢驗檢疫局，江蘇 南通 226018)

2010年的食品安全問題中，由食源性致病菌引起的事件數和中毒人數分別占總數的36.82%和62.10%[1]。最近，在美國暴發李斯特屬細菌(Listeria spp.)感染疫情，截至2011年10月2日，致17人死亡，84人染病。因此，對食源性致病菌的檢測己迫在眉睫。微生物氣味指紋技術作為一種快速、簡便和無損的方法，在微生物的分類、鑒別和檢測上的研究逐漸興起。微生物在生長過程中利用了環境中的營養物質，在酶的作用下產生了揮發性代謝產物，由于個體不同，其代謝方式和途徑也不盡相同，所釋放的揮發性代謝產物的時間、數量、種類也有差別，這些差別構建了微生物的氣味化學條碼。此條碼可以潛在的被用來作為微生物鑒定與檢測的依據[2-3]。

近年來越來越多的研究者報道了基于氣味指紋技術在微生物檢測中的應用，但是系統的分析揮發性代謝產物鮮有報道。在國外，有學者對一些細菌所產生的類似馬鈴薯氣味進行了研究[4]；結合神經網絡分析大腸桿菌的揮發性代謝產物[5]；用手提式電子鼻系統識別了牛肉中培養的沙門氏菌[6]；建立了一種快速預測包裝的新鮮蔬菜中食源性致病菌的含量的方法[7]。比起細菌更早的是用于對真菌的研究[8-10]。在國內，氣味指紋技術在微生物檢測上的應用相對較少，僅用于分析一些細菌的代謝產物及特定物質的含量[11-14]。本實驗室對氣味指紋技術的研究以及在微生物檢測上的應用具有一定的實驗基礎。實驗人員通過電子鼻技術成功區分3種細菌(蠟樣芽孢桿菌、單增李斯特菌、緩慢葡萄球菌)[15]，且進一步對單增李斯特菌培養不同時間后的揮發性代謝產物進行了分析，發現該菌在生長8h后產生特有的揮發性物質[16]；還對一株分離自南美白對蝦的副溶血性弧菌與3株分離自豬肉中的假單胞菌進行研究。結果顯示副溶血性弧菌經純培養后，產生了明顯區別于空白純培養液的揮發性代謝產物；3株假單胞菌的揮發性代謝產物之間存在著差異，并列出相對應的特有物質[17-18]。以上結果均能證實氣味化學條碼可以被用來鑒定與檢測微生物。

本實驗采用氣相色譜-質譜聯用技術與電子鼻技術對5種常見李斯特屬細菌的揮發性代謝產物進行了定性及相對定量的分析研究，得到5株細菌特有的氣味化學條碼，輔以電子鼻驗證其區分結果。實驗結果有望為今后微生物氣味指紋庫的建立提供數據支持，從而建立一種快速、簡便、無損的食源性致病菌新型檢測系統。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腦心浸液肉湯(BHI，每升培養基中含有牛腦200.0g、牛心浸出汁250.0g、蛋白胨10.0g、葡萄糖2.0g、NaCl 5.0g、瓊脂20.0g) 英國Oxoid公司；固相微萃取裝置、萃取頭(50/30μm DVB/CAR/PDMS) 美國Supelco公司。

GCMS-QP2010 Ultra氣相色譜/質譜聯用儀 日本島津公司；Fox-4000 Sensory Array Fingerprint電子鼻(E-nose) 法國Alpha MOS公司。

1.2 樣品處理

實驗菌株如表1所示。

表1 實驗菌株Table 1 Five species of Listeria

檢測樣品制備：將斜面保藏的菌種接種到8mL BHI液體培養基中，于37℃、180r/min的條件下搖床培養(種子液)備用。

GC-MS檢測：取稀釋一定梯度的1.5mL種子液于裝有13.5mL液體培養基的40mL頂空樣品瓶中，置于37℃、180r/min的條件下搖床培養8h，用于GC-MS檢測，每組樣品3個平行。

電子鼻檢測：取20μL的種子液于裝有2mL液體培養基的10mL頂空樣品瓶中，置于37℃、180r/min條件下搖床培養8h，用于電子鼻檢測，每組樣品5個平行。

1.3 檢測方法

1.3.1 固相微萃取進樣

將培養后的樣品瓶于37℃水浴振蕩，用固相微萃取纖維頭萃取35min后，纖維頭插入進樣口解吸5min進樣。

1.3.2 色譜質譜條件

色譜柱：Rxi-5 Sil MS(30m×0.25mm，0.25μm)；SPL進樣口溫度：250℃；不分流進樣，進樣時間：1min；柱溫程序：30℃保持3min，以5℃/min升至160℃，再以13℃/min升至250℃；柱流量：1.0mL/min恒線速度方式；接口溫度：280℃；離子源溫度：230℃；采集方式：掃描m/z 30～400。

1.3.3 電子鼻條件

頂空樣品進樣(由進樣器自動完成)：加熱箱溫度37℃，振蕩速度500r/min，每個樣品加熱600s；分析條件：以合成的干燥空氣為載氣，流速150mL/min，注射體積2.5mL，注射針溫度47℃，注射針總體積2.5mL，注射速度2.5mL/s，獲取時間120s，延滯時間600s[15-16]。

1.4 數據處理方法

利用Origin軟件作圖，并運用PAST軟件中主成分分析法(PCA)與聚類分析法。

2 結果與分析

2.1 樣品總揮發性代謝產物

5株菌的揮發性代謝物總離子流色譜圖如圖1所示。

圖 1 5種李斯特屬菌揮發性代謝產物的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms of volatile compounds from five Listeria spp.

由圖1可見，5種李斯特屬細菌在原始色譜圖上具有差異。通過計算其皮爾森系數(Pearson correlation coefficient)的絕對值，進一步比較5種菌的相關性，其絕對值越大表明相關性越強，結果見表2。除了格氏李斯特菌和綿羊李斯特菌的相關系數為0.810以外，其他菌株之間的相關系數均小于0.7，可見5株李斯特屬細菌的色譜圖存在著明顯的差異。其中，格氏李斯特菌和威爾士李斯特菌之間的相關系數為0.373，兩者的差異最為顯著。

表2 5種李斯特屬菌揮發性代謝產物的總離子流圖相關系數表Table 2 Correlation coefficients for total ion chromatograms of volatile compounds from five Listeria spp.

實驗中GC-MS檢測的每個樣品均有3個平行檢測對象，通過計算平行色譜圖的皮爾森系數絕對值，進一步評價試驗結果的穩定性，所得平均皮爾森系數絕對值見表3。由表3可知，5個樣品的平行色譜圖彼此之間的相關性很高，均在0.890～0.946之間，即相似程度較高。由此可以推斷由GC-MS測得的氣味指紋重現性較好，具有形成區分、鑒定李斯特菌的氣味條碼的潛在能力。

表3 5種李斯特屬細菌揮發性代謝產物的總離子流圖平均相關系數表Table 3 Pearson coefficients for total ion chromatograms of volatile compounds from five Listeria spp.

通過質譜數據庫檢索，確定其化學組成。共得到115種物質，并應用峰面積歸一化法測定了它們的相對含量，其結果見表4。揮發性成分：空白培養基檢測出48種物質，英諾克李斯特菌檢測出59種物質，威爾士李斯特菌檢測出53種物質，綿羊李斯特菌檢測出52種物質，格氏李斯特菌檢測出52種物質，單增李斯特菌檢測出67種物質。5株李斯特屬菌培養后的揮發性代謝產物具有一定的差異。

2.2 樣品間共有物質

在對6個樣品的檢測中，共得到的揮發性物質有11種。分別為2,3-丁二酮、2-丁酮、異戊醛、羥基丙酮、甲苯、2,5-二甲基吡嗪、甲氧基苯基肟、苯甲醛、2-羥基萘、十四烷、正二十烷。其中除去異戊醛、苯甲醛、十四烷、正二十烷4種物質較空白培養基的含量有增有減外，其他共有物質的含量均有增加。

在5種菌培養液的檢測中，相對于空白培養基新產生的共有物質有6種。分別為乙醇、丙酮、3-羥基-2-丁酮、乙酸丁酯、3-甲硫基丙醛、6-丁基壬烷。

2.3 樣品特有揮發性代謝產物

從生物分類學角度上比較，5株李斯特菌它們的遺傳信息存在一定的差異，而這種差異可能使不同細菌對培養基分解能力出現差別，代謝途徑不同從而造成其代謝產物不同。

在檢測結果中也得到了每種菌培養后所獨有的物質。英諾克李斯特菌特有物質：二硫化碳、D-樟腦、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚；威爾士李斯特菌特有物質：3,4-二甲基己烷、5-甲基癸烷、異十三醇、丁基壬烷、4-甲基十四烷、2-異丙基-5-甲基-2-庚醇、3-甲基十七烷、5-甲基-6-丙基壬烷；綿羊李斯特菌特有物質：反-2-庚烯-1-醇、1,3-二氫異苯并呋喃、苯乙醇、左旋樟腦；格氏李斯特菌特有物質：氯氟乙酰胺；單增李斯特菌特有物質：二甲基硫、3-甲基-2-(3-甲基-2-丁烯基)呋喃、3-甲硫基丙醇、3,9-二甲基癸烷、2-丙基-1-庚醇、10-甲基十九烷、9-己基十五烷。以這些物質成分的保留時間及相對含量為特征，形成5種常見李斯特菌特有的氣味化學條碼具有潛在可能性。

2.4 樣品中主要成分及含量

在空白培養基中，揮發性成分中相對含量較高的10個化合物占所有化合物總含量的62.1%。分別是：氨基脲、乙酰肼、異戊醛、2,2,3,4-四甲基丁烷、二甲基二硫、2,3,3-三甲基戊烷、2,5-二甲基吡嗪、2-乙基吡嗪、苯甲醛、3-乙基-2,5-甲基吡嗪。

英諾克李斯特菌揮發性成分中相對含量較高的10個化合物占所有化合物總含量的55.88%。分別是：氨基脲、異丁醛、異戊醛、2-甲基丁醛、二甲基二硫、2,5-二甲基吡嗪、苯甲醛、乙醇、丙酮、3-羥基-2-丁酮。

威爾士李斯特菌揮發性成分中相對含量較高的8個化合物占所有化合物總含量的44.97%。分別是：異戊醛、二甲基二硫、2,5-二甲基吡嗪、苯甲醛、3,8-二甲基癸烷、正二十烷、6-丁基壬烷、2,3,4-三甲基戊烷。

綿羊李斯特菌揮發性成分中相對含量較高的10個化合物占所有化合物總含量的71.17%。分別是：異戊醛、醋酸、2,5-二甲基吡嗪、苯甲醛、3-乙基-2,5-甲基吡嗪、甲硫醇、乙醇、乙酸異戊酯、奧肼、異戊醇。

格氏李斯特菌揮發性成分中相對含量較高的10個化合物占所有化合物總含量的73.72%。分別是：異丁醛、異戊醛、2,5-二甲基吡嗪、苯甲醛、乙醇、乙酸異戊酯、奧肼、異戊醇、2-甲基丁醇、氯氟乙酰胺。

單增李斯特菌揮發性成分中相對含量較高的9個化合物占所有化合物總含量的50.3%。分別是：異戊醛、2-甲基丁醛、2,5-二甲基吡嗪、苯甲醛、乙醇、丙酮、DL-丙氨酰-L-丙氨酸、甲酸異丁酯、二甲基二硫。

表4 5種李斯特屬菌揮發性代謝產物的化學組成Table 4 Chemical compositions of volatile compounds of five Listeria spp.

續表4

2.5 電子鼻檢測

通過電子鼻對樣品氣味的整體指紋信息進行統計學分析。電子鼻檢測原始數據的主成分分析結果見圖2。

圖 2 電子鼻檢測結果Fig.2 Results of electronic nose detection

從圖2可知，由于不同氣體樣本的物質組成不同，從而得到傳感器不同的感應信號。通過儀器模式識別系統對樣品氣味的整體指紋信息進行統計學分析，電子鼻能夠較好的區分5種李斯特菌，同時也說明了5種菌的揮發性代謝產物存在一定差異。圖中5個平行能夠聚集在一起，表明電子鼻具有較好的重復性。各組樣品的整體氣味之間存在差異，由于差異程度不同，樣品之間又具有相似性。5種菌培養物的氣味都能夠與空白培養基(CK)的氣味區分開，英諾克李斯特菌、威爾士李斯特菌的氣味與綿羊李斯特菌的氣味相近，區別于格氏李斯特菌、單增李斯特菌的氣味。結果顯示基于電子鼻的氣味指紋技術能夠很好的將5種李斯特菌區分。

表5 電子鼻5次重復檢測值的相對標準偏差Table 5 Relative standard deviation from five replicates of electronic nose detection

通過分析各樣品5次重復、18根傳感器檢測值的相對標準偏差，見表5，RSD范圍在0.395%～3.634%，5種樣品的平均相對標準偏差分別為2.074%、1.400%、1.588%、2.571%、1.528%，表明傳感器有良好的檢測重復性。

2.6 樣品間氣味物質聚類分析

以6個樣品的共有揮發性物質和培養后5種菌新產生的共有揮發性物質的種類以及相對含量做聚類分析，是利用樣品間歐氏距離的相似性對樣品空間進行分類，如圖3所示。

圖 3 樣品間的聚類圖Fig.3 Cluster analysis of five Listeria spp. and relative contents of new volatile comounds common to their metabolites

從兩部分圖中均可得5種菌培養后的揮發性代謝產物存在差異性。在對6組樣品的共有揮發性物質的種類和相對含量進行比較中(圖3A)，綿羊李斯特菌與格氏李斯特菌的氣味相似；英諾克李斯特菌與單增李斯特菌的氣味相似；而威爾士李斯特菌的氣味明顯區別于其他菌。在對5種菌培養后新產生的共有的揮發性物質的種類和相對含量進行比較中(圖3B)，綿羊李斯特菌與格氏李斯特菌的氣味相似，其次是英諾克李斯特菌和單增李斯特菌；同樣威爾士李斯特菌的氣味明顯區別于其他菌。從圖3顯示的歐式距離來看，根據共有揮發性物質的種類和相對含量能夠更好的區分各個樣品，而它們所形成的化學條碼也更能體現各樣品的特征。

為了比較6個樣品間共有揮發性代謝產物的差異性，使用SPSS 17.0軟件對數據進行方差分析。分析結果中所有P值均小于0.05。如表6所示，在對每一種揮發性化合物的比較上，樣品間均有顯著差異。表明以共有揮發性代謝產物形成的化學條碼能夠很好的體現出樣品間的差異特征。說明此氣味指紋有望成為區分、鑒定5種李斯特菌的化學條碼。

表6 5種李斯特屬細菌共有揮發性代謝產物的相對含量Table 6 Contents of volatile compounds common to five Listeria spp.

3 討 論

本研究所用的李斯特菌目前分為6個種，即單核細胞增生李斯特菌、英諾克李斯特菌、西爾李斯特菌、威爾士李斯特菌、綿羊李斯特菌和格氏李斯特菌，其中只有單增李斯特菌和綿羊李斯特菌有致病性[19]。單增李斯特菌是人蓄共患病病原菌[20]，可以忍受較大范圍的pH值、溫度以及鹽脅迫，可在4℃繁殖生長[21]。因此，加強食源性單增李斯特菌的檢測及監測，勢在必行。

據報道，除少數李斯特菌病爆發的案例與4a和4c血清型有關，大約有98%的李斯特菌病病例是由含1/2a，1/2b和4b這3種血清型的單增李斯特菌引起的，因此它們是引起人類疾病的主要血清型[20]。本研究得到了血清型為4b的單增李斯特菌與其他李斯特菌共有的揮發性代謝化合物及相對含量；形成的化學條碼，有望用來做為單增李斯特菌鑒定的依據。且得到了其培養后特有的氣味指紋化合物，形成了特有的化學條碼(二甲基硫、3-甲基-2-(3-甲基-2-丁烯基)呋喃、3-甲硫基丙醇、3,9-二甲基癸烷、2-丙基-1-庚醇、10-甲基十九烷、9-己基十五烷)。還比較了樣品的主要揮發性代謝物質種類與相對含量，完善了化學信息，可以為今后食源性致病微生物氣味指紋庫的建立提供數據支持。但是考慮到應用氣味指紋技術進行鑒定、檢測是一項正在探索中的研究，想要其具有實際的應用價值需要考慮到氣味指紋的穩定性、重復性等。研究中得到主要信息來源于化學統計分析，并沒有深入到分子層面。對擁有相同致病血清型的菌株之間的化學信息進行研究更具有意義。所以，在接下來的工作中將討論氣味指紋的穩定性與重復性，并對擁有相同病血清型的菌株進行指紋分析。

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