真空包裝羅非魚冷藏過程生物胺生成與微生物生長的相互關系

鐘賽意，劉壽春，秦小明,*，王維民，林華娟，諶素華

(1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524005；2.北京市農林科學院北京農業信息技術研究中心，北京 100097)

生物胺是一類具有生物活性的低分子量有機含氮化合物，廣泛存在于富含蛋白質和氨基酸的水產品、肉制品、干酪、酒類等食品中。適量的生物胺能有效調節生物體的生理代謝功能，但過量攝入則會導致人體產生血壓升高、頭痛、皮疹、腫脹、腹瀉、嘔吐等中毒癥狀[1]。除了天然胺類，食品中的生物胺主要由微生物產生脫羧酶催化氨基酸脫羧作用生成。生物胺的生成與食品自身特性、微生物菌群以及加工貯藏條件有關，進而影響其前體物質氨基酸的含量以及脫羧酶的活性[2]。目前，已有一些關于金槍魚、三文魚、大西洋青魚、沙丁魚、雀鱔魚等海水魚中生物胺生成情況的研究[3-7]，生物胺(尤其是組胺和酪胺)已經被歐美國家建議列入海產品的安全限量攝入[8]，然而很少關于淡水魚中生物胺的研究。羅非魚是我國重要的淡水經濟魚種，其肉厚刺少風味佳，深受國內外消費者歡迎。冷鮮羅非魚在加工貯運過程中難免遭受微生物污染并代謝產生有毒有害物質——生物胺，其生物胺的生成情況與微生物生長的相互關系有待研究。

本研究以冷藏真空包裝羅非魚為研究對象，檢測其常見主要生物胺的含量，同時測定微生物及其他品質指標的變化，建立生物胺與微生物生長的相互關系和回歸方程，為今后基于生物胺變化預測安全食用貨架期提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

厭氧菌瓊脂、發光菌瓊脂、MRS瓊脂 青島海博生物技術有限公司；STAA瓊脂 英國Oxoid公司；乙腈、丙酮、高氯酸 北京藍弋生化試劑有限公司；生物胺標準品 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

JG21002電子天平 上海天平儀器廠；KDY-9820凱氏定氮儀 北京通潤源機電技術有限責任公司；3K15高速冷凍離心機 美國Sigma公司；LC-10 AT液相色譜儀 日本島津公司；C18-Diamondsil(25cm × 4.6mm，5μm)反相色譜柱 迪馬科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 貯藏實驗

鮮活淡水羅非魚擊殺加工成生鮮魚片，清洗，濾水晾干，每片魚片獨立真空包裝后放置于保溫箱中，一層魚一層冰確保低溫運往實驗室；抵達實驗室后，去除冰塊，將包裝好的魚片放置于(5.13 ± 0.51)℃冰箱中貯藏。貯藏過程每隔一段時間隨機取3片魚片進行分析。

1.3.2 指標測定

1.3.2.1 生物胺測定

生物胺采用反相高效液相色譜柱前衍生法測定，按照Kim等[9]方法略作修改：準確稱5g混勻肉樣，加15mL 預冷的0.6mol/L高氯酸，均質后高速低溫離心15min，取上清液；重復操作1次，合并2次上清液并定容。取1mL樣液，依次加入200μL 2mol/L NaOH、300μL飽和碳酸氫鈉溶液和2mL丹磺酰氯，40℃避光反應45min。然后加入100μL氨水，靜置30min，用乙腈定容至5mL，混勻，3000r/min離心10min，有機微孔濾膜過濾，濾液直接測定或于－20℃貯存備用。檢測條件：流動相為0.1mol/L醋酸銨和乙腈，流速0.8mL/min，檢測波長254nm，進樣量10μL。采用外標法測定各種生物胺的含量。

單胺=色胺＋苯乙胺＋組胺＋酪胺；二胺=腐胺＋尸胺；多胺=精胺＋亞精胺；總生物胺=色胺＋苯乙胺＋組胺＋酪胺＋腐胺＋尸胺＋精胺＋亞精胺。生物胺指數(biogenic amine index，BAI)=組胺＋腐胺＋尸胺＋酪胺；質量指數(quality index，QI)=(組胺＋腐胺＋尸胺/(1＋亞精胺＋精胺)。

1.3.2.2 微生物測定

無菌操作稱25g魚肉置于225mL無菌生理鹽水中，振蕩均勻，做10倍系列稀釋，選取適宜稀釋度接種于選擇性培養基。厭氧菌采用厭氧菌瓊脂，接種于厭氧管中，30℃培養48h；乳酸菌接種于MRS瓊脂，30℃培養72h；明亮發光桿菌采用發光菌分離培養基，25℃培養48h；熱殺索絲菌采用STAA瓊脂于25℃培養48h。計算典型菌落，換算成對數值(lgCFU/g)。

1.3.2.3 三甲胺氮測定

三甲胺氮(trimethylamine-nitrogen，TMAN)測定參考Malle等[10]方法進行：準確稱10g混合肉樣，加90mL預冷的0.6mol/L高氯酸，均質，低溫靜置30min，3000r/min離心15min，過濾，取5mL濾液，加入10mL濃甲醛，置于半自動凱氏定氮儀中蒸餾6min，甲醛能與一級和二級胺反應生成六亞甲基亞胺，游離的三甲胺被蒸餾出來，接收液中則是三甲胺的含量，采用0.01mol/L鹽酸標準溶液滴定至中性，通過鹽酸溶液用量換算TMAN含量。

1.3.2.4 酸度測定

酸度的測定參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》酸堿滴定法。

2 結果與分析

2.1 真空包裝羅非魚貯藏過程主要生物胺的變化

圖 1 羅非魚貯藏過程主要生物胺的變化Fig.1 Changes of major biogenic amine during storage

由圖1可知，8種生物胺中，色胺和酪胺的檢出質量濃度很低，其始末含量分別為1.00～5.23mg/kg和1.55～14.47mg/kg，15d以前兩者含量均小于3mg/kg，至19d兩者檢出量開始增加并達到最大值5.23mg/kg和 14.47mg/kg。貯藏過程中，苯乙胺的檢出量在第4天出現一個峰值高達19.42mg/kg，其他時期均小于7mg/kg。雖然上述3者含量在8種生物胺中含量不高，可能與其前體物質色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸在魚體中的含量有關[1]，但總體呈現波動的上升趨勢。組胺在生物胺中毒性最大，4d以前，組胺含量小于3mg/kg，隨后呈現直線快速增加趨勢，第8天增加至25.24mg/kg，比初始值高出11倍，且含量持續增加至貯藏末期92.84mg/kg。組胺主要由組氨酸脫胺作用生成，但一般生鮮羅非魚肌肉中組氨酸含量并不算太高，不是主要氨基酸[11]，因此，組胺的生成可能與蛋白質分解產生更多的組氨酸前體物質有關。

在貯藏中后期(8～19d)，8種生物胺中腐胺占據最高含量，尸胺次之。腐胺和尸胺初始含量并不高，4d以前，分別為4.74～5.61mg/kg和0.73～0.82mg/kg，尸胺含量最低；4～8d，腐胺含量迅速增加至134.92mg/kg，尸胺也增加至19.92mg/kg，比初始值分別增加了28倍和20倍，此期間生物胺的生成反應迅速進行。至第15天，兩者含量達到貯藏期最大值，分別為240.31mg/kg和112.94mg/kg，隨后出現下降趨勢。從整個貯藏過程8種生物胺的變化情況來看，腐胺和尸胺的變化起著主導作用，次之為組胺，即三者為主要生物胺。

8種生物胺中，初始含量最高為精胺和亞精胺，分別為10.09mg/kg和8.09mg/kg，亞精胺在貯藏過程呈現先輕微上升后逐漸下降的趨勢，而精胺呈現先下降后逐漸回升，兩者終含量分別為5.32mg/kg和9.44mg/kg，均低于初始含量。精胺和亞精胺的含量在魚體中普遍含量較高[12]，且研究表明包裝和貯藏溫度對亞精胺含量影響不明顯[13]。因此，精胺和亞精胺不能很好地反映魚肉的品質變化。同樣，本研究結果表明，精胺和亞精胺的變化與貯藏時間沒有良好相關性。

2.2 真空包裝羅非魚貯藏過程不同生物胺種類及總生物胺的變化

生物胺是一類具有生物活性的低分子質量非揮發性的有機含氮化合物，按其合成途徑可分成單胺(酪胺、苯乙胺、組胺、色胺)、二胺(腐胺、尸胺)和多胺(精胺、亞精胺)[2]。就其毒性而言，單胺中的組胺的毒性最大，酪胺次之；二胺中的腐胺和尸胺會增強組胺和酪胺的毒性[1]，精胺和亞精胺作為生理多胺，對生物體內的代謝具有機能性作用。由圖2可知，多胺的含量總體呈下降趨勢，從初始18.88mg/kg下降至19d的14.76mg/kg，其變化對魚肉的貯藏時間沒有顯著影響；單胺的含量呈平緩的直線上升趨勢，從初始9.87mg/kg上升至19d的117.17mg/kg，其主要原因是組胺含量在持續增加；二胺含量顯著高于單胺和多胺，從初始5.47mg/kg增加至263.13mg/kg，并主導著總生物胺的變化趨勢；總生物胺與二胺的變化趨勢基本一致，只在總量上比二胺高，總生物胺從初始34.21mg/kg增加至末期395.06mg/kg；其中單胺和總生物胺的始末含量增加了近12倍，而二胺始末含量增長了48倍，可見二胺是貯藏過程的優勢生物胺。

2.3 真空包裝羅非魚貯藏過程生物胺指標的變化

圖 3 羅非魚貯藏過程生物胺指標的變化Fig.3 Change of biogenic amine indicators during storage

腐胺、尸胺和組胺是本研究真空包裝羅非魚的主要生物胺，也是衡量其他水產品質量安全的主要標準[14]。Veciana-Nogués等[15]提出BAI和QI的限值評價金槍魚的感官可接受性，但兩者的限值隨著貯藏溫度的升高而升高。?zogul等[6]研究表明氣調和真空包裝沙丁魚的BAI和QI與貯藏時間及感官可接受性具有良好的相關性。如圖3所示，BAI和QI均隨著貯藏時間的延長而持續增加，其變化曲線與二胺及總生物胺相似，即先上升后下降。4d以前，BAI(10.05～10.54mg/kg)和QI(0.39～0.47)沒有明顯變化，4d以后，二者快速增加，表明4～8d之間有明顯的變化拐點。由于腐胺、尸胺、組胺是主要生物胺，因此涵蓋其三者的BAI與總生物胺總量非常相近；BAI在一定程度上可以代替總生物胺，尤其在貯藏中后期(8～19d)。Mieltz等[13]建議QI=10是金槍魚的可接受限值，根據該限值，真空包裝羅非魚的可接受期為貯藏8～11d(QI=9.22～16.94)。

2.4 真空包裝羅非魚貯藏過程揮發性含氮化合物的變化

圖 4 羅非魚貯藏過程TMAN和酸度的變化Fig.4 Change of TMAN and acidity during storage

TMAN是魚肉中的鮮味物質氧化三甲胺在厭氧菌的分解還原作用下產生帶有揮發性與腥臭味的含氮化合物，TMAN含量越高，魚的新鮮度越差[16]。鮮活淡水魚中一般不含TMAN，但冷藏1d就能檢出，其含量隨著貯藏時間的延長和魚肉新鮮度下降而逐漸增加，與感官評分、貯藏時間具有高度相關性[17-18]。有學者建議淡水魚TMAN含量應不高于60mg/100g，海水魚應不高于390mg/100g，否則視為腐敗[19]；本研究結果遠遠低于該限值。如圖4所示，初始TMAN為2.55mg/100g，0～8d TMAN增加有個較長的延滯期(含量均＜3mg/100g)，第8天是TMAN變化的重要拐點，隨后開始增加至19d的4.43mg/100g。一般認為魚肉中TMAN的可接受范圍為10～15mg/100g，但魚肉初期腐敗的臨界值因魚種不同存在差異，本研究結果與蔡慧農等[18]較為接近，但明顯低于其他研究結果[17,19-20]，可能與包裝方式和貯藏溫度有關。

由于密閉環境的真空包裝容易使肉中產生乳酸和碳酸，因此包裝內魚肉會產生一種發酸的異味。通過測定酸度來反映真空包裝中魚肉酸化和肉質劣變的情況，本研究的滴定酸度以乳酸為主。如圖4所示，初始酸度為2.95g/kg，隨著貯藏時間的延長，酸度逐漸增加，在15d有輕微的下降，但總體呈線性增加，最終酸度到達9.45g/kg。可見真空包裝魚肉的揮發酸味和肉質軟化與酸度增加存在一定關系。

2.5 真空包裝羅非魚主要微生物菌群的生長情況

圖 5 羅非魚貯藏過程主要微生物菌群變化Fig.5 Change of major microflora during storage

厭氧菌為厭氧滾管中生長的所有厭氧及兼性厭氧的微生物數量，明亮發光桿菌是真空和氣調包裝水產品中的重要革蘭氏陰性菌，乳酸菌和熱殺索絲菌是兼性厭氧或微氧條件下的主要革蘭氏陽性菌，并能在真空和氣調包裝中選擇性生長，對魚肉中氨基酸脫羧作用生成生物胺具有重要作用[2,6]。如圖5所示，厭氧菌與明亮發光桿菌的生長趨勢非常相近，多個時期處于曲線重合狀態，在貯藏中后期(8～19d)，兩者數量均高于乳酸菌和熱殺索絲菌約2(lg(CFU/g))，而乳酸菌數量高于熱殺索絲菌；微生物菌群的數量高低依次為：厭氧菌＞明亮發光桿菌＞乳酸菌＞熱殺索絲菌。表明在兼性厭氧條件下，厭氧菌和明亮發光桿菌能夠更好地生長，兩者分別從初始2.99(lg(CFU/g))和3.26(lg(CFU/g))持續增加至15d最大值9.09(lg(CFU/g))和8.66(lg(CFU/g))，在19d回落至8.25(lg(CFU/g))和8.33(lg(CFU/g))。乳酸菌和熱殺索絲菌的生長速度相對平緩，整個貯藏過程乳酸菌不超過7.5(lg(CFU/g))，熱殺索絲菌不超過6.5(lg(CFU/g))。4類微生物在數量上雖然有差別，但沒有明顯延滯期，且快速生長期均出現在0～4d，第8天開始進入穩定期。從數量上看，厭氧菌和明亮發光桿菌最終均超過8(lg(CFU/g))，而乳酸菌和熱殺索絲菌也達到6～7(lg(CFU/g))，因此不能忽視其在真空包裝魚肉中的生長及其腐敗代謝作用。

2.6 真空包裝羅非魚生物胺生成與微生物生長的相關性

表1 生物胺與微生物生長的相關性Table 1 Correlation between biogenic amines and microbial growth

從表1可看出，微生物生長與貯藏時間呈高度相關性(r=0.829～0.865)；生物胺指標(除了色胺、苯乙胺、酪胺、精胺)與貯藏時間也高度相關(r=0.799～0.968)，其中組胺相關性最高，次之為QI；TMAN、酸度與貯藏時間也高度正相關(r=0.897～0.899)。8種單個生物胺中，腐胺與4種微生物生長的相關性最高(r=0.814～0.887)，次之為尸胺(r=0.675～0.762)，組胺位居第三(r=0.678～0.776)；色胺、苯乙胺、酪胺、亞精胺、精胺與微生物生長沒有相關性。其他生物胺指標與微生物生長的相關性高低順序為：總生物胺＞二胺＞BAI＞QI＞多胺；由于總生物胺中包含了8種生物胺，因此，二胺、BAI的應用性可能更簡便。酸度與微生物生長的相關性高于上述任何生物胺指標(r=0.893～0.973)，表明魚肉中酸度的增加與微生物生長關系密切。

2.7 生物胺生成與微生物生長預測魚肉品質變化

根據表1中生物胺與貯藏時間、微生物、TMAN以及酸度的相關性獲得的主要結果，采用逐步回歸分析對上述指標全部選入進行篩選擬合，以貯藏時間為因變量，其他指標為自變量，根據顯著性大小逐步進入模型中，擬合標準回歸系數，進而獲得模型的指標、擬合度以及誤差等參數，見表2。最終共有5個指標進入模型中，其顯著性高低順序依次為：組胺、厭氧菌、尸胺、單胺和BAI；其中組胺的線性回歸判定系數已達到0.936，即組胺1個變量對于貯藏時間函數的解釋能力為93.6%，綜合其他4個指標能達到100%的解釋能力，且標準誤差均小于2.0，方程P值均為0.000(極顯著)，表明回歸方程的擬合度非常好。考慮到本研究中優勢生物胺(腐胺、尸胺、組胺)與微生物的指數生長具有高度相關性，見表1，且線性回歸方程不能完整地反映某些指標的非線性變化，因此，使用多元線性回歸模型，其預測精度和有效性要高于一元線性回歸方程，因此表2中的方程3可能更適用于本研究結果。另外，因變量(y)的選擇是影響預測模型有效性的關鍵因素，具體因變量的選擇以及預測模型精度有待更深入的研究和驗證。

表2 真空包裝羅非魚多指標的逐步回歸分析Table 2 Stepwise regression analysis of indicators in vacuum-packed tilapia

3 結 論

真空包裝羅非魚冷藏過程中，腐胺、尸胺、組胺是優勢生物胺；二胺和BAI能有效反映總生物胺的變化；厭氧菌和明亮發光桿菌生長良好，最高數量超過8.0(lg(CFU/g))；色胺、苯乙胺、酪胺、亞精胺、精胺與微生物生長不相關，其他生物胺指標與微生物生長具有良好相關性；二胺和BAI作為生物胺評價指標的應用性可能更簡便；通過多指標逐步回歸分析獲得良好擬合度的多元線性回歸方程：貯藏時間(y)=0.125×組胺＋0.941×厭氧菌＋0.022×尸胺－2.918。

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