綠豆胰蛋白酶抑制劑的含量、多型性及穩定性

江均平，李春紅，張 濤，云冬梅，楊雪豐

(1.中國農業科學院農產品加工研究所，農業部農產品加工綜合性重點實驗室，北京 100193；2.中國農業科學院作物科學研究所，北京 100081；3.北京農學院食品科學與工程學院，北京 102206)

胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor，TI)泛指具有抑制胰蛋白酶活性作用的一類物質，廣泛存在于動物、植物和微生物中，在體內能與相應的胰蛋白酶形成一定的動態平衡，調節生物體內許多重要的生命活動，在生物的生理體系中發揮重要作用。臨床上TI對潰瘍性結腸炎[1]、輻射損傷[2-3]、HIV和腫瘤[4-6]等有一定的療效；農業上可以用于病蟲害防治；食品工業上用來抑制蛋白酶，防止香腸、肉丸、低鹽魚產品、海洋藍鲹魚糜凝膠軟化[7-8]，改善肉類食品的質構。

但是TI是一種抗營養因子，抑制消化道胰蛋白酶和糜蛋白酶的活性，降低蛋白質的消化。另外，TI與腸內胰蛋白酶結合后隨糞便排出體外，使腸內胰蛋白酶數量減少，引起胰腺反射性亢進，分泌量加大，同時腸促胰酶肽分泌也增加，這種雙重的過分刺激胰腺分泌，勢必造成胰腺分泌失調性肥大和增生[9]。胰蛋白酶中含有豐富的含硫氨基酸，體內胰蛋白酶的流失會造成體內含硫氨基酸的內源性散失，致使體內氨基酸代謝失調或不平衡。

綠豆(Vigna radiata(L.) R. Wilczek)原產于中國，已有2000多年的栽培史，印度、緬甸、朝鮮、日本等國均有栽培，在人們生活中占有十分重要的地位。綠豆中含有一定量的TI，其比活力是大豆TI的2.76倍[10]，而且耐熱、耐酸[11]，但目前缺乏大面積栽種品種TI含量、多型性及穩定性的基礎數據，這些數據對綠豆TI資源的開發利用以及科學食用綠豆都有參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠豆品種26份，來自我國主產區，品種名稱和產地見表1；紅豆品種：遼引紅豆(產地遼寧沈陽)、京農21、XD1(產地吉林白城)；黑豆品種：綏03-3772(產地黑龍江齊齊哈爾)、成都安德公司小粒黑豆、中農綠谷公司小粒黑豆。

苯甲酰-DL-精氨酸-對硝基酰胺鹽(BAPNA) 美國Sigma公司；胰蛋白酶(1：250)(酶活力＞250NFU/mg) 美國Bio Basic公司；明膠為化學純。

1.2 儀器與設備

1093 CYCLOTEC旋風磨 瑞典Foss公司；UV-752型紫外-可見分光光度計 上海元析公司；TU-20DTEMPUN IT精密恒溫水浴鍋 英國Techne公司；DYY-8C電泳儀 北京六一公司。

1.3 酶的提取

綠豆用旋風磨磨成8 0 目，置于冰箱備用。取1000.0mg綠豆粉用20mL蒸餾水于150mL三角瓶中180r/min振蕩提取1h(37℃)，12000r/min離心10min得提取液。

1.4 胰蛋白酶抑制劑活性測定

1.4.1 測定原理

參照文獻[12-13]進行。胰蛋白酶可催化水解BAPNA，引起410nm波長處吸光度增加，而胰蛋白酶抑制劑加入上述體系后，抑制了胰蛋白酶的活性，使410nm波長處吸光度增加的幅度有所減少，以其減少程度表示此抑制劑的抑制能力，從而計算出抑制活性。

1.4.2 溶液配制

Tris-HCl緩沖液：0.294g CaCl2·H2O用100mL 0.05mol/L、pH8.2 Tris-HCl緩沖液溶解；BAPNA溶液：20.0mg BAPNA先用0.5mL二甲基亞砜溶解，再用37℃的Tris-HCl緩沖液定容至50mL；胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶40mg先用2mL 1mmol/L鹽酸溶解，再用蒸餾水定容至50mL。

1.4.3 指標測定

1.4.3.1 胰蛋白酶活性測定

Tris-HCl緩沖液0.5mL、提取劑(dH2O)0.2mL、胰蛋白酶溶液0.2mL，37℃保溫5min后，加入BAPNA溶液0.5mL，保溫10min后加入乙酸0.2mL，混勻，以空白對照(即在進行反應時最后加酶液)作參比，測定410nm波長處的吸光度(AT)。

1.4.3.2 蛋白酶抑制劑活性測定

Tris-HCl緩沖液0.5mL、TI溶液0.2mL、胰蛋白酶溶液0.2mL，37℃保溫5min后，加入BAPNA溶液0.5mL，保溫10min后加入30%乙酸0.2mL，混勻，以空白對照(在進行反應時最后加酶液)作參比，測定410nm波長處的吸光度(ATI)。

1.4.3.3 計算方法

抑制劑活性單位定義為：在上述反應條件下抑制1mg 1：250的胰蛋白酶活性所需要的抑制劑量為1個單位(TIU)。

1.5 高溫對抑制劑穩定性的影響

取0.5mL提取液于帶螺旋蓋的菌種冷凍管中，加入0.5mL蒸餾水，擰緊蓋子，于100℃水中30min，取出立即于自來水中冷卻，然后檢測殘余活性及酶譜變化。

1.6 酸性條件對抑制劑穩定性的影響

吸取0.5mL上清液于離心管中，再加入0.5mL 0.05mol/L、pH1.5的KCl-HCl緩沖液，靜置8h。然后檢測殘余活性及酶譜變化。

1.7 電泳分析[14-15]

稱取1000.0mg豆粉用50mL蒸餾水于150mL三角瓶中振蕩提取1h (37℃、180r/min)，12000r/min離心10min得TI提取液。提取液用蒸餾水稀釋5倍，與等體積電泳樣品緩沖液混合，取20μL進行明膠-PAGE。采用不連續垂直平板電泳系統，5%濃縮膠，12%分離膠，兩種膠均含0.2%明膠，電極緩沖液為pH 8.3 Tris-甘氨酸；濃縮膠電壓80V，分離膠150V，待溴酚藍帶跑出膠后繼續電泳1h；取膠于培養皿中，用100mL胰蛋白酶溶液(25μg/mL，用脫酶液配制)振動酶解20min(搖床轉速50r/min、37℃)，倒盡酶液，倒置培養皿，繼續保溫90min，然后用50mL脫酶液(pH7.5 0.05mol/L Tris-HCl，0.2mol/L NaCl，0.01mol/L CaCl2)漂洗凝膠2min，共漂洗3次；考馬斯亮藍R-250染色60min(搖床轉速50r/min、37℃)，0.25mol/L NaCl溶液脫色。

2 結果與分析

2.1 不同綠豆種質胰蛋白酶抑制劑含量

表1 不同綠豆品種胰蛋白酶抑制劑活性(±s，n=3)Table 1 TI activity of mung bean cultivars (±s，n=3)

表1 不同綠豆品種胰蛋白酶抑制劑活性(±s，n=3)Table 1 TI activity of mung bean cultivars (±s，n=3)

綠豆 產地TI活性/(TIU/g)綠豆 產地TI活性/(TIU/g)鄭綠8號 河南南陽35.2±0.3白綠522吉林白城42.2±2.6冀綠7號 河北石家莊53.5±2.2白綠8號 吉林白城35.4±3.3冀綠8號 河北石家莊42.0±2.4保942-34吉林白城32.7±1.7冀綠9號 河北石家莊31.2±2.1保綠942吉林白城40.7±0.7橫山大明綠豆 陜西榆林38.4±3.3大鸚哥綠935吉林白城35.1±1.6神木綠豆 陜西榆林36.0±4.7冀綠19-2吉林白城43.2±2.2淮綠5號 山東青島49.6±4.8冀綠2號 吉林白城37.5±2.9突泉明綠豆 內蒙古突泉44.0±2.2佳木斯綠 吉林白城35.4±3.4扎魯特綠豆 內蒙古突泉30.2±0.7金峰綠豆直徑3.6吉林白城29.0±0.3遼綠8號 遼寧沈陽43.2±5.7金峰綠豆直徑3.8吉林白城33.6±1.7綠豐5號 黑龍江齊齊哈爾 34.8±2.2品種2號 吉林白城41.3±2.6綠豐2號 黑龍江齊齊哈爾 36.4±0.0中綠5號 吉林白城51.3±1.4 200143-10綠 吉林白城35.5±0.0中綠10號 吉林白城43.5±1.7

由表1 可知，2 6 個綠豆栽培品種T I 平均含量為38.9TIU/g，冀綠7號、中綠5號活性最高，分別達53.5、51.3TIU/g，金峰綠豆直徑3.6最低，只有29.0TIU/g，高低相差0.8倍。

2.2 綠豆胰蛋白酶抑制劑多型性

圖 1 綠豆、紅小豆、黑大豆TI活性電泳酶譜Fig.1 TI zymogram of mung bean, adzuki bean and black soybean on Gel-PAGE

用非變性電泳TI活性染色方法對3個綠豆品種、3個紅小豆品種以及3個黑大豆品種TI進行分析，結果如圖1所示。綠豆有4條帶，M2為主要組分，M4次之，其他微量；紅小豆有7條帶，其中A4為主要組分，A2、A6次之，其他微量，京農21缺失A3，A2含量也極低；黑大豆有8條帶，S3為主要組分，S4、S7、S8為次要組分，其他微量。

2.3 綠豆胰蛋白酶抑制劑耐熱性

圖 2 綠豆TI熱、酸處理活性顯色電泳圖Fig.2 TI activity staining PAGE of crude extract from mung bean treated by heat and acid

TI提取液于沸水中處理30min，冀綠7號、中綠5號、淮綠5號這3個品種的殘余活性為66.4%～83.1%(表2)，明膠-PAGE活性顯色有一定強度的活性帶，見圖2B，表明綠豆TI具有較高的耐熱性。冀綠7號M4消失，出現5條新帶(M5～M9)，中綠5號、淮綠5號未產生新帶。

表2 綠豆胰蛋白酶抑制劑酸、熱穩定性Table 2 Thermal and pH stability of mung bean TI

2.4 綠豆胰蛋白酶抑制劑耐酸性

由表2可知，TI提取液經pH1.5處理8h，冀綠7號、中綠5號的活性有所增加，達110.0%和107.7%，淮綠5號保存86.3%的活性，表明綠豆TI耐酸?；钚噪娪窘Y果表明，冀綠7號M4消失，出現5條新帶(M5～M9)(圖2A)，中綠5號、淮綠5號未產生新帶。

3 討論與結論

3.1 TI種類及含量

供試的26個綠豆品種平均含38.9TIU/g，品種間差異較大，高低相差0.8倍。實驗對3種黑大豆、17種紅小豆的TI含量進行了測定，綠豆平均含量比紅小豆、黑大豆低5倍以上。綠豆有4種TI，其中M2為主要組分。紅小豆、黑大豆分別有7種、8種TI，主要組分分別為A4、S3。豆類TI種類及含量與植物品種、生理狀態以及受病蟲侵害程度有關[16]，TI的多型性具有重要的生物學意義，因為TI參與多種生理活動，因此需要不同種類和豐度的TI，如種子萌發、抗病蟲等。據報道[17]新原料TI含量最高。實驗發現提取液在冰箱放置一定時間后酶譜會改變。放置10d后M4顯著增加，M1、M2、M3明顯減少，因此，在研究TI多型性和含量時，必須用新材料及新提取液。

3.2 熱穩定性

Klomklao等[11]報道綠豆TI經90處理60min可以保存90%以上的活性，本實驗結果也表明綠豆TI具有較高的熱穩定性。這些結果表明普通烹調方法不能完全使其失活。經100℃煮30min冀綠7號的M4消失，同時產生了M5～M9共5條活性帶。

3.3 酸穩定性

Klomklao等[11]報道綠豆TI經pH2.0緩沖液處理30min保存87%的活性，本實驗研究的3種綠豆經pH1.5處理8h，其中有2種的活性高于原液，另一種保存86.3%的活性，表明綠豆TI可以耐受胃酸。經pH1.5處理，冀綠7號的M4消失，同時產生了M5～M9共5條活性帶。

3.4 TI存在狀態

冀綠7 號經熱或酸處理后M4消失，同時產生了M5～M9共5條新活性帶，推測M4是以結合態形式存在。

利用明膠-PAGE分析TI種類和豐度受多因素的影響，如加樣量、胰蛋白酶質量濃度、酶解時間、溫度以及酶解方式。本研究采用低胰蛋白酶質量濃度(25μg/mL)、短時間(20min)浸泡酶解，然后倒掉酶液繼續保溫90min讓殘留在凝膠中的胰蛋白酶將明膠水解，這樣可以避免TI被溶液中過量的蛋白酶所飽和而被降解，從而能夠比較精細、準確分析TI種類及豐度。

綠豆TI屬于Borman-Birk型絲氨酸蛋白酶抑制劑，由72個氨基酸殘基組成，分子中含有7對二硫鍵[18-19]，結構穩定，耐熱耐酸，常規加熱烹調和胃酸不能使其完全失活。豆類TI一方面可以抑制蛋白酶的活性影響蛋白的利用，但TI也具有一定的抑癌效果[4-6]，因此，如何科學食用綠豆值得深入研究。

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