紫甘薯醋及其不同發酵階段產物的抗氧化活性

張村雪，朱渭兵，李志西,*，殷路萍，劉健書

(1.西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；2.楊凌金薯種業科技有限公司，陜西 楊凌 712100；3.陜西省功能食品工程技術研究中心，陜西 西安 710054)

紫甘薯屬旋花科一年生草本植物，是甘薯的一個特殊品種，又名黑紅薯，薯皮黑紫色，薯肉紫紅色，是日本九州農業實驗場培育出的高色素新品種，由于富含花青素、植物蛋白、多糖、維生素、礦質元素等多種重要活性成分而一度成為研究和開發的熱點[1-3]。據日本學者須田郁夫等[4]研究表明，紫色甘薯具有極強的抗氧化活性，可去除活性氧，預防高血壓，改善肝功能，減少基因突變，抑制誘癌物質的產生。

國內外關于紫甘薯汁、紫甘薯酒、紫甘薯乳酸飲料和紫甘薯醋的抗氧化活性[5-7]已有報道。日本學者須田郁夫等[8]通過實驗表明紫甘薯汁可以清除體內自由基，推遲動脈硬化中LDL(低密度脂蛋白)的氧化。王杉等[9]研究表明，紫苷薯色素具有顯著的抗生物氧化作用，可延緩衰老。楚文靖等[10]研究表明，由m(熟紫薯)：V(水)=1：1.5釀造的紫甘薯酒比相同酒精度(約11%)的干紅葡萄酒具有更強的抗氧化能力，且發酵后紫甘薯酒的抗氧化活性與紫甘薯汁相當。Terahara等[11]對不同品種的食用醋(白醋、黑醋、魚醋、蘋果醋、紫甘薯醋)進行比較，結果顯示紫甘薯醋與其他醋相比，具有更強的清除游離O2－·和DPPH自由基的活性。但是對于紫甘薯醋發酵階段產物(糖化醪、酒醪、醋液)抗氧化活性比較研究的報道尚且少見。本研究以紫甘薯(黑署1號)、黃心甘薯(陽東錦栗薯)、白心甘薯(秦薯5號)、橘黃心甘薯(紅心648)為原料，比較紫甘薯與其他3個品種甘薯的糖化醪、酒醪及醋液抗氧化活性的強弱，為紫甘薯的開發及深加工提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑薯1號、秦薯5號及紅心648(黑薯1號薯肉深紫色，秦薯5號薯肉為白色，紅心648薯肉橘黃色) 楊凌金薯種業科技有限公司；陽東錦栗薯(薯肉為黃色) 仲愷農業工程學院(廣州)。棗醋(1)由實驗室自制。4.5g/100mL(以醋酸計)。干棗加4倍水進行酒精發酵，發酵結束后漿渣分離，得酒醪，采用液態深層發酵法釀制成棗醋，酸度。

淀粉酶、糖化酶 北京奧博星生物技術有限責任公司；酵母菌 湖北安琪酵母股份有限公司；醋酸菌 上海中科伍佰豪生物工程有限公司；福林酚試劑 上海荔達生物科技有限公司；蘆丁、沒食子酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2’-連氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS) 美國Sigma公司；氯化鈣、無水碳酸鈉、無水乙醇、抗壞血酸、K2S2O8均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1700型紫外-可見分光光度計 日本島津公司；TD5A型臺式離心機 湖南凱達科學儀器有限公司；HH-S4型數顯恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；THZ-82A型水浴恒溫振蕩器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；KH5200B型超聲波清洗器 昆山禾創超聲儀器有限公司；噴射式自吸發酵罐 實驗室自制[12]。

1.3 方法

1.3.1 甘薯醋釀制工藝

將清洗后的甘薯蒸熟，按照m(熟甘薯)：V(水)=1：1.3加水打漿，經液化、糖化等步驟后冷卻，得到糖化醪，加入0.1g/100mL酒用活性干酵母，置于酒精發酵罐內，在25℃條件下酒精發酵3d，4000r/min離心15min分離得到甘薯酒醪。再接入體積分數10%的醋酸菌種子液，于34℃條件下采用噴射式自吸發酵罐[12]進行液態深層發酵。

1.3.2 DPPH自由基清除能力測定

參照金杰等[13]所用方法，略有改動。準確吸取稀釋適當倍數的樣品100μL，用去離子水補至2mL，同時加入2mL 0.1mmol/L的DPPH溶液，搖勻，避光放置30min后用無水乙醇作參比在波長510nm處測定其吸光度Ai，同時測定2mL 0.1mmol/L DPPH溶液與2mL無水乙醇混合后的吸光度Ac，以及2mL相應質量濃度的樣品溶液與2mL無水乙醇混合后的吸光度Aj，按式(1)計算清除率。

參照文獻[14]方法即VCEAC法(VC當量質量濃度)，測定不同質量濃度VC對DPPH自由基的清除率，以VC質量濃度(0～6mg/100mL)為橫坐標，VC對DPPH自由基的清除率為縱坐標作圖得標準曲線，線性回歸方程為：y＝10.3040x－0.0883(R2=0.9988)。樣品的DPPH自由基清除能力以VC當量質量濃度(VCEAC)表示。

1.3.3 ABTS+·清除能力測定

參考Re等[15]方法。ABTS+·由5mL 7mmol/L的ABTS溶液和88μL 140mmol/L的K2S2O8水溶液避光反應24h后生成。使用前用無水乙醇稀釋至734nm波長處吸光度為1.00±0.02，稀釋液當天使用。分別取稀釋適當倍數的樣品溶液200μL，再加入4.8mL ABTS稀釋液混勻，避光反應15min，以無水乙醇為對照，在734nm波長處測定吸光度，空白以相同體積甲醇代替樣品反應，按照式(2)計算樣品的ABTS+·清除率。

式中：Ac為同體積甲醇代替樣品反應的吸光度；Ai為樣品反應的吸光度。

用VC溶液為標準對照，測定不同質量濃度VC對ABTS+·的清除率，以VC質量濃度(0～12mg/100mL)為橫坐標，V C 對A B T S+·的清除率為縱坐標作圖得標準曲線，線性回歸方程為：y ＝6.2 7 7 8 x－1.9964(R2=0.9981)，樣品的ABTS+·清除能力用VC當量質量濃度(VCEAC)表示。

1.3.4 Fe3+還原能力測定

參照Oyaizu[16]方法，略有改動。分別取稀釋適當倍數的樣品溶液1mL，加入2.5mL磷酸緩沖液(0.2mol/L pH6.6)混勻，再加入1g/100mL的鐵氰化鉀溶液2.5mL；50℃水浴恒溫20min后，加入10g/100mL的三氯乙酸溶液1mL，3000r/min離心10min，取上清液2.5mL，加去離子水2.5mL以及0.1g/100mL三氯化鐵溶液0.5mL，在7 0 0 n m 波長處測定吸光度。用V C 溶液為標準對照，測定不同質量濃度VC反應所得吸光度，以VC質量濃度(0～12mg/100mL)為橫坐標，吸光度為縱坐標作圖得標準曲線，線性回歸方程為：y= 0.1010x－0.0057(R2=0.9994)，樣品還原Fe3+能力用VC當量質量濃度(VCEAC)表示。

1.3.5 紫甘薯(黑署1號)花色苷含量的測定

參考霍琳琳等[17]方法，略有改動。確定適當的稀釋倍數，使樣品吸光度在分光光度計的線性范圍內；制備2個樣品稀釋液，其中一個用氯化鉀緩沖液(0.2mol/L，pH1.0)稀釋，另一個用醋酸鈉緩沖液(0.2mol/L，pH4.5)稀釋。將樣品稀釋液穩定15min后，用蒸餾水做空白，分別測定2種樣品稀釋液在520nm和700nm波長處的吸光度A。按式(3)、(4)計算花色苷(以矢車菊-3-葡萄糖苷計)含量。

其中：Mw為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾質量(449.2g/mol)；n為稀釋倍數；1為比色皿的寬度(1cm)；ε為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數，26900L/(mol·cm)；103為轉換系數。

1.3.6 總多酚含量的測定

參考Cai Yizhong等[18]方法，略有改動。以沒食子酸為標準品，準確配制0.1mg/mL的沒食子酸標準溶液，分別吸取此標準溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL于10mL容量瓶中，依次加入Folin-Ciocalteu試劑2.0mL和7.5g/100mL的碳酸鈉溶液2.0mL，去離子水定容至10mL，搖勻后顯色2h，在波長765nm處測定吸光度。以沒食子酸質量濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度(A765nm)為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程：y=88.429x+0.0012(R2=0.9994)。

將各樣品稀釋適當的倍數，配成樣品溶液，準確吸取各樣品溶液100μL，分別置于10mL容量瓶中，按上述方法分別測定吸光度(A)，代入回歸方程計算樣品中的總多酚含量。

1.3.7 總黃酮含量的測定

參考李利華[19]方法，略有改動。以蘆丁為標準品，將蘆丁于120℃干燥至恒質量，準確配制0.4mg/mL的標準溶液，分別吸取此標準溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5mL于10mL容量瓶中，加入5g/100mL亞硝酸鈉溶液0.5mL混合均勻，放置6min，然后加入10g/100mL硝酸鋁溶液0.5mL混合均勻，放置6min，最后加入4g/100mL氫氧化鈉溶液4mL，蒸餾水定容，放置15min，測定510nm波長處吸光度。以蘆丁質量濃度(mg/mL)為橫坐標，吸光度(A510nm)為縱坐標繪制標準曲線，得到線性回歸方程：y=12.324x+0.0114(R2=0.9997)。

將各樣品稀釋適當的倍數，配成樣品溶液，準確吸取各樣品溶液1mL，置于10mL容量瓶中，按上述方法分別測定吸光度(A)，代入回歸方程計算樣品中的總黃酮含量。

1.3.8 數據分析

2 結果與分析

2.1 DPPH自由基清除能力的比較

DPPH是一種穩定的自由基，可溶于甲醇等有機溶劑呈紫色[20]，在波長517nm處有最大光吸收度。當有自由基清除劑存在時，其顏色減退，褪色程度與清除能力呈定量關系。因此可通過分光光度法進行定量分析，從而評價抗氧化物質的抗氧化能力[13]。

圖 1 各樣品發酵過程中清除DPPH自由基能力變化Fig.1 DPPH scavenging activity of each sample during fermentation process

由圖1可知，各樣品的DPPH自由基清除能力在品種間差異很大，紫甘薯(黑薯1號)發酵產物的清除能力約為其他3種甘薯的8～9倍。李紅蕊[21]研究表明，棗醋具有較強的DPPH自由基清除能力，且清除能力高于苦蕎醋、柿子醋等，而黑薯1號發酵產物的清除能力約為棗醋的4倍，由此可以看出黑薯1號發酵產物具有很強的抗氧化活性，這可能是由于其含有豐富的花色苷、綠原酸、異綠原酸等功能成分[22]。各樣品的DPPH自由基清除能力依次為：黑薯1號＞棗醋＞秦薯5號＞紅心648＞陽東錦栗薯。對黑薯1號醋釀制過程中不同發酵階段產物進行比較，可以看出，酒精發酵及醋酸發酵使其DPPH自由基清除能力顯著提高。

VC當量質量濃度分別為：糖化醪(98.30±3.34)mg/100mL、酒醪(116.09±1.94)mg/100mL、醋液(120.23±3.17)mg/100mL；這可能是由于甘薯醋在釀制過程中發生了復雜的物質變化，酚類物質的組成、結構及含量可能因發酵狀態而發生改變，而結構不同的酚類物質對抗氧化能力的貢獻也不盡相同[23]。陽東錦栗薯、秦薯5號、紅心648的糖化醪、酒醪、醋液清除能力也有一定變化，其中，秦薯5號、紅心638的酒醪及醋液較之糖化醪清除能力有顯著提高，陽東錦栗薯不同發酵階段產物清除能力無顯著差異。

2.2 ABTS+·清除能力的比較

ABTS與一定濃度的過硫酸鉀避光反應12～16h，經活性氧氧化后生成穩定的藍綠色陽離子自由基，抗氧化物質與ABTS+·反應后使其反應體系褪色，吸光度降低，降低越顯著則表明被測物質的抗氧化能力越強[24]。

圖 2 各樣品發酵過程中清除ABTS+·能力變化Fig.2 ABTS scavenging activity of each sample during fermentation process

由圖2可知，ABTS+·清除能力在品種間存在較大差異，黑薯1號發酵產物遠高于陽東錦栗薯、秦薯5號、紅心648及棗醋，與DPPH自由基清除能力趨勢一致。對同一品種不同發酵階段產物的清除能力進行比較，可以看出，黑薯1號醋液的ABTS+·清除能力較之糖化醪、酒醪顯著升高，VC當量質量濃度分別為：糖化醪(205.28±3.07)mg/100mL、酒醪(190.26±5.87)mg/100mL、醋液(247.80±8.36)mg/100mL，這可能是由于醋酸發酵過程中總多酚含量升高，且有些物質發生轉化，生成具有較強抗氧化活性的成分。陽東錦栗薯、秦薯5號、紅心648醋液的ABTS+·清除能力也有顯著的提高。

2.3 Fe3+還原能力的比較

Fe3+還原能力的測定也是用來評價物質抗氧化能力的常用方法之一。待測物中的還原性物質與鐵氰化鉀反應生成亞鐵氰化鉀，再與Fe3+生成普魯士藍[25]。因此可通過比色法來進行定量分析，吸光度越大，還原能力越強。

由圖3可知，各個樣品Fe3+還原能力存在品種間差異，黑薯1號發酵產物遠高于其他3個品種甘薯以及棗醋，還原能力大小依次為：黑薯1號＞棗醋＞秦薯5號＞紅心648＞陽東錦栗薯，表現出與清除DPPH自由基和清除ABTS+·相似的趨勢。黑薯1號糖化醪、酒醪、醋液的Fe3+還原能力均存在顯著性差異，VC當量質量濃度分別為：糖化醪(156.03±4.96)mg/100mL、酒醪(177.97±4.42)mg/100mL、醋液(220.46±6.03)mg/100mL，這可能與其花色苷及多酚類物質含量在發酵過程中的變化有關，且花色苷、VC、類胡蘿卜素等活性成分與酚類物質的協同作用可能使其還原能力有所提高[26]。陽東錦栗薯、秦薯5號、紅心648的糖化醪、酒醪、醋液的Fe3+還原能力也有不同程度的變化，其醋液較之糖化醪、酒醪的還原能力均有顯著提高。

圖 3 各樣品發酵過程中Fe3+還原能力變化Fig.3 Reducing power of each sample during fermentation process

2.4 花色苷、總酚、總黃酮含量比較及相關性分析

2.4.1 花色苷含量紫甘薯花色苷屬于多酚類物質，它具有消除活性氧、清除自由基等抗氧化作用[27]。對紫甘薯(黑薯1號)不同發酵階段產物花色苷含量進行測定，得其含量分別為：糖化醪(183.82±8.07)mg/L、酒醪(184.25±11.03)mg/L、醋液(178.90±18.39)mg/L。紫甘薯酒精發酵、醋酸發酵前后花色苷含量無顯著差異(P＞0.05)。

2.4.2 總酚、總黃酮含量比較

表1 各樣品發酵過程中總酚及黃酮含量的變化Table 1 Total polyphenols and total flavonoids contents in each sample during fermentation process

由表1可知，不同品種及不同發酵階段甘薯的總酚及總黃酮含量存在較大差異。其中黑薯1號的總酚及總黃酮含量遠高于陽東錦栗薯、秦薯5號、紅心648及棗醋，從高到低依次為黑薯1號、棗醋、秦薯5號、紅心648、陽東錦栗薯，與樣品抗氧化活性變化趨勢相一致；其次，甘薯醋釀制過程中，發酵狀態對總酚、總黃酮含量也有不同程度的影響。酒精發酵后，可能由于發酵過程中多酚及黃酮類物質發生了氧化、聚合、沉淀等反應[28]，黑薯1號發酵產物的總酚含量及黃酮含量均有下降；醋酸發酵使其總酚含量略有升高，可能是因為醋酸菌等微生物代謝產生了一些多酚類物質[29]；黑薯1號醋液的總黃酮含量較之糖化醪有所降低，這可能是由于發酵過程中黃酮類物質因光照及空氣作用發生不同程度的分解；其次，pH值、金屬離子也會對黃酮含量有一定的影響。陽東錦栗薯、秦薯5號、紅心648不同發酵階段產物的多酚和黃酮含量都有一定程度變化，醋液的多酚含量均顯著升高，紅心648醋液黃酮含量較之糖化醪顯著下降，陽東錦栗薯、秦薯5號醋液較之糖化醪均無顯著變化。

2.4.3 總酚、總黃酮含量與樣品抗氧化能力相關性分析

將3種抗氧化能力評價方法下得到的VC當量質量濃度(VCEAC)分別與總酚含量、總黃酮含量作相關性分析，結果如表2所示。樣品的總多酚、總黃酮含量與其DPPH自由基和ABTS+·清除能力、Fe3+還原能力呈極顯著相關(P＜0.01)，說明多酚類物質、黃酮類物質對其抗氧化能力有顯著影響。

表2 樣品抗氧化能力與總多酚及總黃酮含量的相關系數Table 2 Correlation coefficients between antioxidant activity and total polyphenols or total flavonoids contents

3 結論與討論

本研究比較了紫甘薯(黑薯1號)與黃心甘薯(陽東錦栗薯)、白心甘薯(秦薯5號)、橘黃心甘薯(紅心648)不同發酵階段產物(醋液及其糖化醪、酒醪)的抗氧化活性，并且與棗醋做了對比。研究結果表明：4種甘薯的發酵產物都有較強的DPPH自由基清除能力、ABTS+·清除能力和Fe3+還原能力，抗氧化能力大小依次為黑薯1號＞秦薯5號＞紅心648＞陽東錦栗薯；其中，黑薯1號抗氧化能力高出另外3種甘薯4～9倍。實驗證明，黑薯1號不同發酵階段產物含有大量花色苷，而花色苷是清除自由基的主要活性物質[23]，這可能是黑薯1號抗氧化能力遠高于其他3個品種甘薯的主要原因。

實驗表明，紫甘薯醋的抗氧化能力高于棗醋，其DPPH自由基清除能力和Fe3+還原能力約為棗醋的4倍，ABTS+·清除能力約為棗醋的2倍。經過酒精發酵、醋酸發酵，紫甘薯發酵產物的抗氧化能力有不同程度的提高，其酒醪及醋液的DPPH自由基清除能力顯著高于糖化醪，ABTS+·清除能力大小依次為醋液＞糖化醪＞酒醪，Fe3+還原能力從高到低依次為醋液＞酒醪＞糖化醪，由此可以看出，經過醋酸發酵，紫甘薯醋的抗氧化能力有所升高。酒精發酵及醋酸發酵并未對花色苷含量造成顯著影響，但是醋液的總多酚含量顯著升高，且發酵過程中，多酚類物質及黃酮類物質可能會發生復雜的物質及結構變化，這可能是引起醋液抗氧化能力升高的主要原因，但要確定具體的變化形式以及多酚和黃酮中的哪些成分、哪些結構起到主要的抗氧化作用，還需要進一步深入研究。

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