干燥方式對葡萄皮多酚及其抗氧化活性的影響

郭澤美，任章成，陳 騰，馬娜娜，房玉林,2,*

(1.西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100；2.陜西省葡萄與葡萄酒工程技術研究中心，陜西 楊凌 712100)

植物多酚具有較強的抗氧化能力，能有效清除體內自由基、抑制脂質過氧化以及保護機體生物大分子等[1]。葡萄廢棄物中含有大量以植物多酚為主的生物活性物質，如白黎蘆醇、酚酸、黃酮、兒茶素、表兒茶素、原花青素等[2]，大量研究[3-6]表明這些物質具有很高的抗氧化活性，具有護肝解毒、抗菌抗癌[7-9]、抗過敏、預防高血壓、皮膚保健及美容等功效[10]。

近年來我國葡萄與葡萄酒行業發展迅速，葡萄酒生產過程中產生了大量廢棄皮渣。最初這些廢棄物被用作肥料、飼料、燃料，甚至被當作垃圾處理，不僅利用率低，而且易造成環境污染。因此，高效利用釀酒葡萄皮渣對增加經濟效益和減少環境污染均有重要意義[11]。隨著人們對食品安全的關注，食品抗氧化劑正逐漸由工業合成轉向天然提取[12]，而葡萄酒工業生產中產生的大量皮渣是生產天然抗氧化劑的理想原料[13]，目前已有研究者將葡萄皮渣提取物添加到肉類和食用油脂中的研究被報道[14-15]。此外，葡萄皮渣還被應用于日化、環保領域，以及被用作木質黏合劑[16]和處理污水[17]等。

干燥處理能抑制物質的呼吸作用以及其他生理作用，減少營養物質損失，避免微生物活動，有利于物質的保藏[18]。食品等加工行業常用的干燥方式主要有曬干、凍干、烘干、陰干、微波干燥及真空干燥等[19-20]。酒廠常采用日曬方式干燥葡萄皮渣以降低成本、提高效率，但有相關研究顯示冷凍干燥比烘干更有利于減少干燥過程中葡萄果皮酚類物質的損失[21]。本實驗擬通過研究不同干燥方式對釀酒葡萄皮渣酚類物質含量及抗氧化活性的影響，為選擇最適宜葡萄皮渣的干燥工藝提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒葡萄皮渣：采自新疆焉耆盆地，為葡萄酒浸漬發酵完，皮籽分離后洗凈得到。

沒食子酸、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、(+)-兒茶素、蘆丁、p-二甲氨基-肉桂酸(p-DMACA) 美國Sigma公司；香草醛、鐵氰化鉀、水楊酸、甲醇(均為分析純) 天津市博迪化工有限公司。

1.2 儀器與設備

KQ-300D E型數控超聲波清洗機 昆山儀器有限公司；RC-5C-PLUS型高速冷凍臺式離心機 美國Kendro公司；UV-1700紫外分光光度計、萬分之一電子天平 日本島津公司；ZMQS 5001型超純水制備儀 美國Millipore公司；HH.W21.600S型電熱恒溫水浴鍋 上海躍進醫療器械廠。

1.3 方法

1.3.1 干燥處理

采用日曬干燥、低溫凍干、熱風烘干及陰干4種對設備和條件要求較低的干燥方式，其中日曬干燥、陰干分別在新疆和碩地區室外和室內進行，其干燥溫度分別約為28℃和20℃；低溫凍干在實驗室條件下進行，溫度為－49℃；考慮到酚類物質的熱敏性[22]，熱風烘干溫度為(60±1)℃，以防止溫度過高使得酚類物質的過多損失，4種方式干燥后用液氮研磨成粉末狀，密封避光保存。

1.3.2 葡萄皮渣多酚類物質提取

采用超聲輔助法提取，準確稱取3.00g葡萄皮粉末，用30mL酸化甲醇溶液(1mol/L HCl-MOH-水體積比1：80：19)，在100W、25℃功率條件下超聲輔助提取30min，然后8000×g低溫離心15min，收集上清液，重復2次，合并提取液。

1.3.3 多酚類物質的測定

1.3.3.1 總酚含量的測定

采用福林-肖卡法[23]。取50μL的提取液，加入2.5mL稀釋10倍的福林肖卡試劑和2mL 7.5g/100mL的碳酸鈉溶液，混勻，45℃條件下避光反應15min后于765nm波長處比色測定吸光度，每個處理重復3次，結果以沒食子酸等價值表示(mg/100g)。標準曲線以沒食子酸標準溶液繪制，其質量濃度梯度為0、5、10、15、20、25、30mg/L。

1.3.3.2 總類黃酮含量的測定

參照Makris等[24]的方法進行。吸取提取液0.1mL，用甲醇稀釋2倍，加入0.4mL蒸餾水，0.03mL 5g/100mL的亞硝酸鈉溶液，反應5min后加入0.03mL 10g/100mL的氯化鋁溶液，振蕩搖勻靜置5min，加入0.2mL 1mol/L的碳酸鈉溶液和0.24mL蒸餾水，搖勻，在510nm波長處測定吸光度。以蒸餾水替代提取液作對照。每個處理重復3次，結果以蘆丁等價值表示(mg/100g)。標準曲線以蘆丁標準溶液繪制，其質量濃度梯度為0、50、100、150、200、250、300mg/L。

1.3.3.3 總黃烷-3-醇含量的測定

采用p-DMACA-鹽酸法[25]進行。將提取液稀釋2倍后取0.1mL，加入3mL的0.1% p-DMACA的1mol/L的鹽酸甲醇溶液，充分振蕩混勻后，室溫條件下反應10min，在640nm波長處測定吸光度，每個處理重復3次。結果以(+)-兒茶素等價值表示(mg/100g)。標準曲線以(+)-兒茶素標準溶液繪制，其質量濃度梯度為0、12.5、25、50、100、200mg/L。

1.3.3.4 總花色苷含量的測定

葡萄皮渣中總花色苷的測定采用pH示差法[26]。提取液分別用pH1.0的鹽酸-氯化鈉緩沖液及pH4.5的醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋20倍，15min后分別在510nm與700nm波長處測定這2種稀釋液的吸光度。最后吸光度(A)通過公式(1)計算。

總花色苷含量用矢車菊素-3-葡萄糖苷(CGE，mg/L)表示，并通過公式(2)計算。

式中：MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷相對分子質量(449)；DF為稀釋倍數；ε為摩爾吸光系數(29600L/(mol·cm))；Ve為提取液總體積(0.06L)；m為葡萄皮取樣質量(3.00g)。

1.3.4 抗氧化能力測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除力的測定

參考江慎華等[27]的方法。DPPH反應液的配制：將12.5mg DPPH試劑用甲醇溶解，定容至100mL，配成125mg/L的DPPH母液。使用時稀釋5倍至25mg/L，并且現配現用。

移取0.1mL稀釋10倍的提取液，加3.9mL DPPH甲醇溶液，在避光條件下反應20min，在515nm波長處測定吸光度，并以相同體積的15%乙醇代替葡萄皮提取液樣品為對照，結果以Trolox等價值(μmol Trolox/g)表示。標準曲線以沒食子酸標準溶液繪制，其質量濃度梯度為0、20、40、60、80、100mg/L。

1.3.4.2 鐵氰化鉀還原力(PFRA)的測定

參考韓林等[28]的方法進行。取0.1mL提取液，依次加入2.5mL 0.2mol/L磷酸二氫鈉-磷酸一氫鈉緩沖液(pH 6.6)、2.5mL 1g/100mL鐵氰化鉀溶液，混勻后置于50℃水浴鍋中反應20min，取出快速放入冰水浴中冷卻5min，再加入2.5mL 10g/100mL三氯乙酸溶液混勻，于6000×g離心10min。吸取1mL上清液，并依次加入2.5mL去離子水，0.5mL 0.1g/100mL三氯化鐵溶液，混勻，反應5min后于700nm波長處測定吸光度。抗氧化活性大小由吸光度反映，吸光度越大表示抗氧化能力越強。

1.4 數據處理

實驗數據采用Microsoft Excel 2010處理，用IBM SPSS Statistics 19.0進行分析。

2 結果與分析

2.1 不同干燥方式葡萄皮渣干燥效果比較

表1 不同干燥方式下葡萄皮渣的含水量和干燥時間Table 1 Moisture content of grape skin and drying time needed for different drying methods

由表1可知，葡萄皮渣相對含水量為：烘干＜曬干＜陰干＜凍干，除凍干和陰干外，不同干燥方式間有極顯著差異(P＜0.01)；而干燥時間也有相同的趨勢，即烘干＜曬干＜陰干＜凍干，且相互間差異達到極顯著水平(P＜0.01)。這是由于溫度越高，水分運動越劇烈，有利于水分散失，使得葡萄皮渣含水量越低，所需干燥時間越短。

2.2 不同干燥方式葡萄皮渣的多酚類物質含量

圖 1 不同干燥方式條件下葡萄皮渣總酚含量Fig.1 Total polyphenols content of grape skin processed by different drying methods

實驗測得沒食子酸標準曲線方程為y=0.0174x+0.0089(R2=0.997)。由圖1可知，4種干燥方式處理的葡萄皮渣，其總酚含量大小順序為：烘干＞曬干＞陰干＞凍干，且不同干燥方式之間都存在極顯著差異(P＜0.01)。其中烘干樣品總酚含量為88.84mg/100g，而干燥條件更為溫和的陰干和低溫凍干卻分別只有71.45、47.63mg/100g，這可能是由于多酚氧化酶的作用。Jang等[29]認為多酚氧化酶(PPO)在室溫條件下最為活躍，而在溫度較高時其活性受到抑制，溫度高于70℃時甚至會失活。Gabriela等[30]通過研究發現葡萄多酚氧化酶活性在25℃時最大，并隨溫度增高而逐漸下降；而其穩定性隨溫度增高而下降。熱風烘干和曬干溫度分別為(60±1)℃和28℃，較高的溫度使得多酚氧化酶活性降低，從而使得皮渣酚類物質損失較少；陰干過程中葡萄皮渣中多酚物質在多酚氧化酶作用下損失較多，而凍干過程中多酚氧化酶在低溫條件下較為穩定，雖然其活性在低溫下受到抑制，但凍干結束后的回溫過程其活性得以增強，從而造成皮渣多酚物質的損失。此外，干燥時間對皮渣多酚化合物含量產生直接影響。這是由于在干燥過程中，葡萄皮渣與氧氣充分接觸，多酚氧化酶對多酚化合物的氧化起催化作用，干燥時間越長，多酚氧化酶作用時間也越長，多酚化合物因氧化損失也就越多。

圖 2 不同干燥方式條件下葡萄皮總類黃酮的含量Fig.2 Total fl avonoids content of grape skin processed by different drying methods

由圖2可知，不同干燥方式的葡萄皮渣總類黃酮含量大小依次為：曬干＞烘干＞陰干＞凍干，最高值為403.56mg/100g，最低值為111.78mg/100g，4種干燥方式間均存在極顯著差異(P＜0.01)。類黃酮包括花青素、黃酮醇、黃烷醇及原花青素等，是葡萄果皮中含量較多的一類酚類化合物，與其他酚類化合物一樣，類黃酮對溫度也比較敏感。研究表明高溫(45℃)條件下長時間存放均會使總類黃酮含量減少[31]，但短時間的高溫處理對總酚和總類黃酮含量影響較小[32]。與總酚情況類似，烘干和曬干的葡萄皮渣，因為溫度較高、干燥較快，能有效抑制相關酶的活性和降低其穩定性，減少其作用時間，使得總類黃酮含量較陰干和凍干處理的多；而高溫可能在一定程度上使類黃酮分解，使得曬干處理的總類黃酮含量較烘干處理多。陰干和凍干的葡萄皮渣干燥時間太久，所以總酚和總類黃酮含量都要低。

圖 3 不同干燥方式條件下葡萄皮渣總黃烷-3-醇的含量Fig.3 Total fl avan-3-ols content of grape skin processed by different drying methods

由圖3可知，不同干燥處理的葡萄皮渣中，烘干處理的樣品總黃烷-3-醇含量最高，達276.15mg/100g；然后依次為曬干、陰干、凍干，其中凍干處理最低，為105.82mg/100g，且4種干燥方式間均存在極顯著差異(P＜0.01)。與總酚含量測定結果相同，不同干燥條件下多酚氧化酶的活性和穩定性差異以及作用時間的不同是導致該結果的重要原因。

圖 4 不同干燥方式條件下葡萄皮渣總花色苷含量Fig.4 Total anthocyanins content of grape skin processed by different drying methods

由圖4可知，烘干處理的葡萄皮渣總花色苷含量最高為5.95mg/g，其次為凍干、曬干、陰干，含量分別為4.78、4.37、4.15mg/g，相互間均存在極顯著差異(P＜0.01)。花色苷大量存在于葡萄果皮中，是葡萄重要的呈色物質。花色苷穩定性較差，受pH值、氧氣、酶、光及溫度等因素影響[33]。溫度對花色苷影響非常大。首先，溫度影響花色苷的熱穩定性，研究[34]表明在高溫和貯存過程中花色苷會不斷降解；其次，溫度可以通過控制酶活性來影響花色苷含量。烘干過程溫度較高，會導致花色苷熱分解，但所需干燥時間較少，從而在一定程度上減少了花色苷的損失；且高溫有助于抑制相關酶的活性，有效防止了花色苷因酶催化降解，因而其花色苷含量最高。凍干處理雖溫度低能避免花色苷受熱分解，但其干燥過程緩慢，可能使得酶作用時間較長使得花色苷損失較多；除較高溫度的作用外，光也能加速花色苷的降解，因此曬干處理的皮渣較凍干的花色苷含量低；適宜酶作用的溫度及較長的干燥時間使得陰干處理的花色苷最少。

2.3 不同干燥方式葡萄皮渣的抗氧化能力

DPPH自由基清除能力是常見的評價抗氧化能力的指標，與總酚含量呈正相關，并與總抗氧化能力也有很強的相關性[25-26]。由圖5可知，4種干燥方式處理的葡萄皮渣的DPPH自由基清除能力存在極顯著差異(P＜0.01)，其中烘干最優，然后依次為曬干、陰干、凍干處理，這與總酚含量測定結果一致。

圖 5 不同干燥方式條件下葡萄皮DPPH自由基清除能力Fig.5 DPPH scavenging capacity of grape skin processed by different drying methods

圖 6 不同干燥方式條件下葡萄皮鐵氰化鉀還原能力Fig.6 Potassium ferricyanide reducing power of grape skin processed by different drying methods

抗氧化活性受反應條件、底物及產物影響，與DPPH自由基清除力相比，鐵氰化鉀還原力從另一個方面反映體系的抗氧化活性。由圖6可知，不同干燥處理葡萄皮渣的鐵氰化鉀還原能力由高到低分別為：烘干＞曬干＞陰干＞凍干，相互間均存在極顯著差異(P＜0.01)。該結果與總酚含量及DPPH自由基清除力相一致。

綜合DPPH自由基清除力和鐵氰化鉀還原力情況來看，不同干燥方式的葡萄皮渣抗氧化活性差異顯著，且烘干＞曬干＞陰干＞凍干。

2.4 相關性分析

表2 干燥葡萄皮渣中酚類物質及抗氧化活性的相關性分析Table 2 Correlation analysis between polyphenol content and antioxidant activity of dry grape skin

由表2可知，除總花色苷含量外，其他各指標間均呈正相關，其中總黃烷-3-醇與總酚含量、DPPH自由基清除能力和鐵氰化鉀還原力均呈顯著相關性(P＜0.05)，總酚含量與鐵氰化鉀還原力顯著相關(P＜0.05)。表明總酚含量、總黃烷-3-醇含量及抗氧化性之間關系密切。

3 結 論

葡萄皮渣經曬干、凍干、烘干和陰干處理后，相互間總酚、總類黃酮、總黃烷-3-醇含量和總花色苷含量差異極顯著(P＜0.01)，其中烘干樣品的總酚、總黃烷-3-醇含量和總花色含量均最高，其抗氧化能力也最強。各指標間均呈正相關，其中總酚含量和總黃烷-3-醇含量與抗氧化能力相關性顯著(P＜0.05)。綜合評價得烘干干燥處理下葡萄皮渣多酚類物質損失最少，其抗氧化能力最好；其次為日曬干燥處理。考慮到葡萄酒廠在生產過程中產生的皮渣量較大，采用日曬干燥葡萄皮渣更為經濟合理。

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