魚腥草素鈉對銅綠假單胞菌生物被膜的影響

王 艷，程惠娟*，朱玲玲，孫振新，李露天

(安徽中醫藥大學，安徽 合肥 230038)

每年由細菌感染造成的死亡人數超過13萬，是世界第二大死亡原因，其中細菌對抗生素的耐藥性對人類生存構成了重大威脅[1]。細菌形成的生物被膜是細菌易產生耐藥性的重要因素。1978年Costerton首先發現并提出了生物被膜(biofilm)理論[2]。隨后，一些研究者在難治性的慢性呼吸道感染、慢性泌尿系感染、骨髓炎、心內膜炎、前列腺炎的病例中，都發現了生物被膜細菌[3]。細菌的生物被膜是細菌為適應周圍不利環境，分泌的多糖基質、纖維蛋白、脂蛋白等將其自身包繞其中形成的膜樣物，是細菌群體生長的一種方式，較之于浮游菌，被膜內菌對抗生素及殺菌劑耐受力更強[4-6]，因此，尋找以生物被膜為靶向的藥物是解決目前細菌耐藥性的重要突破口。

銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)是一種常見的院內感染條件致病菌，被世界衛生組織公認為醫院內感染的主要病原菌之一，臨床上常見于呼吸道感染[7]。該菌在感染機體過程中常以生物被膜方式存在，以此來阻隔抗生素的攻擊[8-9]。在前期的研究中，課題組成功通過體外銅綠假單胞菌產膜株的感染建立了肺氣虛證的模型[10-13]，并針對此病理模型的治療進行了大范圍的藥物篩查。

魚腥草為三白草科蕺菜屬植物蕺菜的干燥地上部分和新鮮全草，味辛、微寒、歸肺經，具有清熱解毒、利尿通淋、止血、祛痰止咳、鎮痛等多種功能。目前，魚腥草被國家衛生部正式確定為“既是藥品，又是食品”的極具開發潛力的植物資源之一[14-15]。魚腥草素鈉是魚腥草的主要有效成分和亞硫酸氫鈉加成物，是臨床常用藥物魚腥草注射液的主要成分，具有消腫，抗化膿感染的功效。主治呼吸道感染及皮膚化膿感染[16-17]。對老年人肺炎、急性上呼吸道感染、慢性支氣管炎急性發作期均有良好的療效[18-19]。在前期的體外抗菌實驗中發現，魚腥草素鈉相較抗生素而言抗菌作用不顯著，但在治療由銅綠假單胞菌生物被膜感染造成的大鼠肺氣虛證模型時，效果理想。而且有實驗證實魚腥草素鈉對表皮葡萄球菌生物被膜有影響[20]，因此推測該藥是否通過干擾銅綠假單胞菌生物被膜的形成，解除它的生物屏蔽作用，從而促進機體的免疫因素殺滅細菌。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚腥草素鈉標準品(批號100247-199601) 中國藥品生物制品檢定所；標準菌株ATCC27853 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心；LB培養基、胰酶大豆肉湯培養基、M-H培養基 杭州微生物試劑有限公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT) 美國Sigma公司；二甲基亞砜(DMSO) 天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器與設備

318酶標儀 上海三科儀器有限公司；96孔微量培養板 杭州生友生物技術有限公司；DPH-9162型電熱恒溫培養箱 上海一恒科技有限公司；CX21型光學顯微鏡 日本Olympus公司；Sirion200型場掃描電鏡 美國Fei公司。

1.3 方法

1.3.1 魚腥草素鈉對銅綠假單胞菌的MIC及抗菌活性

魚腥草素鈉對銅綠假單胞菌的MIC參考ANSI推薦的NCCLS M7-A方案用微量稀釋法進行，魚腥草素鈉以M-H培養基對倍稀釋成10個質量濃度梯度：300、150、75、37.5、18.75、9.38、4.69、2.34、1.17、0.59μg/mL，分別加入96孔板中，每個質量濃度8個復孔，100μL/孔。另設一列不含魚腥草素鈉的培養基作為正常對照組，6h培養的菌液以比濁法調整到0.5號麥氏濃度，經200倍稀釋后，每孔加入100μL，振蕩，37℃培養18h，以無菌生長的最小藥物稀釋度為MIC。然后在酶標儀650nm波長處檢測OD650nm值，比較各藥物質量濃度的抗菌活性。

1.3.2 魚腥草素鈉對銅綠假單胞菌代謝影響

將魚腥草素鈉用胰酶大豆肉湯稀釋成10個質量濃度梯度：300、150、75、37.5、18.75、9.38、4.69、2.34、1.17、0.59μg/mL，分別加入96孔板，100μL/孔，每個質量濃度8個復孔，第11、12列的8個復孔中加入100μL不含魚腥草素鈉的胰酶大豆肉湯，11列為不加魚腥草素鈉的正常對照組，12列作為培養基空白對照，1～11列各孔中加入100μL 1×104CFU/mL的細菌懸浮液；37℃培養每隔48h換一次含藥培養基，設1、3、7d 3個時間點，MTT法在酶標儀492nm波長處檢測OD492nm計算SMIC50和SMIC80。

1.3.3 魚腥草素鈉抗銅綠假單胞菌生物被膜動態過程的形態觀察

選用SMIC80作為含藥培養基的藥物最終質量濃度，將含藥培養基分別加入到六孔板中設1、3、7d時間點3個孔，3.6mL/孔，另設相應不含藥正常對照孔，將400μL的1×104CFU/mL的銅綠假單胞菌的菌體混懸液加入六孔板中，各孔放入1片無菌蓋玻片作為載體，37℃培養，每48h換一次含藥培養基，分別取出蓋玻片，PBS充分清洗浮游菌后鍍銀染色，掃描電鏡下觀察形態。

1.3.4 載體濾膜上活菌計數

體外生物被膜構建同1.3.3節。設魚腥草素鈉對銅綠假單胞菌代謝影響實驗中測得的SMIC50藥物質量濃度為低劑量藥物組，SMIC80藥物質量濃度為高劑量藥物組，載體選用孔徑0.22μm醫用濾膜，設1、3、7d 3個時間點分別取出濾膜，用生理鹽水多次漂洗，洗去浮游菌，濾膜剪碎放入存有5mL無菌生理鹽水的試管，超聲振蕩(超聲頻率40kHz)20min，使膜內菌釋放，連續稀釋法，傾注培養計算活菌數。

1.3.5 統計方法

2 結果與分析

2.1 魚腥草素鈉對銅綠假單胞菌的MIC及抗菌活性

魚腥草素鈉對銅綠假單胞菌的MIC為300μg/mL，由圖1可知，與正常對照組比較，300μg/mL魚腥草素鈉抗銅綠假單胞菌作用顯著(P＜0.01)，隨著魚腥草素鈉質量濃度減小，抗菌活性減弱，150、75、37.5μg/mL魚腥草素鈉之間還有一定的抗菌活性(P＜0.05，P＜0.01)。

圖 1 魚腥草素鈉對銅綠假單胞菌抗菌活性(±s，n=4)Fig.1 Antibacterial activity of sodium houttuyfonate against Pseudomonass aeruginosa (±s，n=4)

2.2 魚腥草素鈉對銅綠假單胞菌代謝影響

不加藥的含菌培養孔的OD492nm為1，含藥孔的光密度是對照孔的0.2、0.5倍即為SMIC80、SMIC50，結果見表1。SMIC80、SMIC50和正常對照組相比差異顯著(P＜0.01)，見圖2。

表1 魚腥草素鈉對銅綠假單胞菌的SMIC(±s，n=4)Table 1 SMIC of sodium houttuyfonate against Pseudomonas aeruginosa (±s，n=4)μg/mL

表1 魚腥草素鈉對銅綠假單胞菌的SMIC(±s，n=4)Table 1 SMIC of sodium houttuyfonate against Pseudomonas aeruginosa (±s，n=4)μg/mL

組別 培養時間/d 1 3 7魚腥草素鈉SMIC509.3818.7537.5魚腥草素鈉SMIC8037.537.5150

圖 2 魚腥草素鈉對銅綠假單胞菌代謝影響(±s，n=4)Fig.2 Effect of sodium houttuyfonate on the metabolism of Pseudomonas aeruginosa ((±s，n=4)

2.3 魚腥草素鈉抗銅綠假單胞菌生物被膜動態過程的形態觀察

由圖3可知，正常對照組銅綠假單胞菌從黏附到成熟生物被膜形成的過程，銅綠假單胞菌培養1d在載體上已經完成了吸附并形成了微菌落集團，周圍可見到少量黏液，給藥組培養1d細菌量少，可見藥物干擾了細菌吸附到載體上。正常對照組3d培養的載體可觀察到初步生物被膜形態，細菌已經被生物被膜覆蓋，但是依稀還能看到細菌形態，培養到7d時由黏液組成的生物被膜增厚，細菌完全被埋到膜內致使菌體不可見。給藥組1d和3d的載體菌體清晰，但是菌體表面較藥物作用7d的菌體粗糙可能是細菌還有少量黏液分泌所致，但是細菌周圍未見黏液，藥物作用3d的載體細菌數量多于作用1d的載體，可能是細菌在載體上繁殖所致，藥物作用7d時載體菌量少，且菌體光滑，可見隨著藥物作用時間延長，對細菌分泌黏液抑制作用增強，且載體上細菌較3d藥物作用的載體少，可能是菌體表面變得光滑不易吸附載體所致。

圖 3 魚腥草素鈉抗銅綠假單胞菌生物被膜形態觀察(×20000)Fig.3 Morphological observation of Pseudomonas aeruginosa biofilm formed in the presence or absence of sodium houttuyfonate(×20000)

2.4 載體濾膜上活菌計數

表2 載體濾膜上的活菌計數(±s，n=4)Table 2 Live bacterial count on carrier in the membrane filter(±s，n=4)104 CFU/mL

表2 載體濾膜上的活菌計數(±s，n=4)Table 2 Live bacterial count on carrier in the membrane filter(±s，n=4)104 CFU/mL

注：*. 與正常對照組相比差異顯著(P＜0.05)；**.與正常對照組相比差異極顯著(P＜0.01)。

組別 培養時間/d 1 3 7正常對照組955±2881130±3021026±451魚腥草素鈉低劑量組831±228*785±177*234±14**魚腥草素鈉高劑量組375±249**147±38**129±24**

由表2可知，魚腥草素鈉藥物組載體濾膜上的活菌數明顯少于未用魚腥草素鈉作用的正常對照組，其中魚腥草素鈉高劑量組在黏附階段、初步生物被膜形成、成熟生物被膜形成階段與正常對照組相比差異顯著(P＜0.01)，尤其在成熟生物被膜形成階段，低劑量組與正常對照組相比也差異顯著。

3 討 論

自然界細菌以浮游和生物被膜兩種生活方式存在，當細菌處于浮游狀態時常導致急性感染的發生，生物被膜狀態的細菌引起慢性感染。雖然也有多種抗生素有抗生物被膜的作用，且抗生素殺菌作用較強，但是當慢性感染時，長期使用抗生素是不合適的。目前臨床治療生物被膜病仍以抗生素治療為主，抗生素對于細菌生物被膜病的治療是一個時間較長的過程，在抗生素選擇性壓力下這一過程將加大細菌耐藥性變異的頗率，而天然植物藥和抗生素相比具有較少形成耐藥性，毒副作用小兩大優點。

魚腥草生長在中國中東部以及西南地區，作為“藥食兩用”植物已經有2000多年歷史。魚腥草、魚腥草素鈉在臨床治療慢性感染性疾病有很好的療效，由于慢性感染性疾病的反復發作、遷延不愈與細菌形成生物被膜相關，因此推測魚腥草素鈉可能通過抑制細菌生物被膜達到對慢性感染性疾病的治療效果。本研究體外實驗顯示魚腥草素鈉300μg/mL抗銅綠假單胞菌的活性最強，隨著藥物質量濃度減少抗菌活性減弱，至18.75μg/mL及以下質量濃度幾乎無抑菌作用。但是其干擾生物被膜的作用強于它的抗菌活性，根據Sauer等[21]報道的銅綠假單胞菌生物被膜的形成階段，本實驗選擇1、3、7d 3個時間點作為生物被膜形成過程的黏附階段、初步生物被膜形成階段、成熟生物被膜形成階段，從膜內菌代謝變化的最小抑膜質量濃度顯示魚腥草素鈉有較強的抗銅綠假單胞菌生物被膜的活性，細菌培養1d是細菌的黏附階段，抑制50%和80%的細菌黏附需要9.37、75μg/mL的藥物質量濃度，培養3d干擾初步生物被膜SMIC50、SMIC80分別是18.75μg/mL和37.5μg/mL藥物質量濃度，培養7d干擾成熟生物被膜SMIC50、SMIC80分別是37.5、150μg/mL。從干擾成熟生物被膜的藥物質量濃度對照MIC分析，結合掃描電鏡對生物被膜形態變化的觀察，藥物質量濃度必須要用抗菌活性才有干擾生物膜的作用。活菌培養檢測表明，魚腥草素鈉在黏附，初步生物膜、成熟生物膜階段都具有明顯的干預作用。結合以上體外實驗結果，魚腥草素鈉對銅綠假單胞菌產膜株所致肺氣虛證模型的具體影響還有待動物實驗進一步證實。由于魚腥草素鈉可以通過消除生物屏蔽，進而促進抗生藥物的滲透，致使藥物直接作用細菌，殺滅細菌，除此之外也有利于機體抗體和吞噬細胞發揮抗感染作用。因此如果和抗生素聯合治療生物膜相關的感染，應該可以收到更好的療效。

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