單寧酸對纖維素酶和木聚糖酶活力的影響

田 野，歐仕益*

(暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632)

多酚類物質廣泛存在于植物的根、皮、木、葉和果內，且含量豐富，在許多針葉樹皮中的含量高達20%～40%，僅次于纖維素、木質素和半纖維素。此外，植物多酚具有許多活潑位點賦予它一系列獨特的化學性質，其中植物多酚與蛋白質的結合是其最重要的特性之一[1]。

纖維素酶和木聚糖酶均屬于高度專一的水解生物催化劑，在水解纖維質時起協同作用[2-4]。纖維素酶與木聚糖酶已廣泛應用于食品工業中，如水解纖維多糖獲得單糖和低聚糖、增加細胞壁的通透性從而提高細胞內含物(如蛋白質、淀粉、油脂、糖等)的提取率、簡化食品加工工藝等[5-7]。但食品原料中豐富的多酚類物質對酶的影響限制了酶解效率。因此，研究多酚與酶的相互作用對食品工業生產具有重要意義。

單寧又稱鞣質，是植物的主要多酚類物質，按其化學結構可分為水解單寧和縮合單寧兩大基本類型[8-9]。本實驗在多酚中選擇單寧酸，將其按不同質量濃度分別添加到酶反應體系中，研究單寧酸對纖維素酶和木聚糖酶的影響，從而為工業生產提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

纖維素酶(1400U/mg)、木聚糖 廣州市齊云生物技術有限公司；濾紙 杭州特種紙業有限公司；木聚糖酶(2500FXU(W)/g) 諾維信(中國)生物技術有限公司；單寧酸 天津市福晨化學試劑廠；3,5-二硝基水楊酸 美國Sigma-Aldrich公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

SHA-B水浴恒溫振蕩器 江蘇金壇市醫療儀器廠；HH-4恒溫水浴鍋 江蘇金壇市宏華儀器廠；KDC-1044低速離心機 科大創新股份有限公司中佳分公司；紫外-可見分光光度計、熒光光譜儀 美國Perkin Elmer儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 單寧酸對酶活力的影響

1.3.1.1 單寧酸對纖維素酶活力的影響

將濾紙剪成紙片(1cm×1cm)烘干后作為酶解底物。用0.1mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.0)配制質量濃度為10mg/mL的纖維素酶液和0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL的單寧酸溶液。取100mL三角瓶，各加入1g濾紙片、10mL單寧酸溶液和20mL酶液，在50℃的恒溫振蕩器振蕩(100r/min)反應3h后，置于沸水浴中15min終止酶促反應。離心，取1mL上清液，用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)測定還原糖，各處理重復3次[10]。

1.3.1.2 單寧酸對木聚糖酶活力的影響

用0.1mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.5)分別配制質量濃度為2mg/mL的木聚糖酶液和5mg/mL的木聚糖液，以及質量濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0mg/mL的單寧酸溶液。按1.3.1.1節方法設置酶促反應體系，反應結束后測定還原糖，各處理重復3次。

1.3.2 單寧酸影響酶活性的動力學研究

1.3.2.1 單寧酸影響纖維素酶活性的動力學研究

用0.1mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.0)配制質量濃度為2、4、6、8、10mg/mL的羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液、4mg/mL的纖維素酶液及2.5mg/mL的單寧酸溶液。取5支10mL試管分別加入2mL纖維素酶液，在50℃水浴中孵育10min后，再依次加入2mL單寧酸溶液和4mL不同質量濃度的CMC-Na溶液，繼續孵育5min。立即置于沸水浴中滅活。離心，取2mL上清液用3,5-二硝基水楊酸法(DNS法)測定還原糖，各處理重復3次。采用Lineweaver-Burk雙倒數法制得酶動力學曲線，并計算Km和Vmax值。

1.3.2.2 單寧酸影響木聚糖酶活性的動力學研究

分別配制質量濃度為2、4、6、8、10mg/mL的木聚糖液，2.5mg/mL的單寧酸以及4mg/mL的木聚糖酶液(0.1mol/L、pH5.5醋酸-醋酸鈉緩沖液配制)，按1.3.2.1節方法進行實驗。采用Lineweaver-Burk雙倒數法制得酶動力學曲線，并計算Km和Vmax值。

1.3.3 單寧酸對酶紫外差示光譜的影響

1.3.3.1 單寧酸對纖維素酶紫外差示光譜的影響

用0.1mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.0)配制質量濃度為4.7mg/mL纖維素酶液和質量濃度為0.4、0.9、1.8、3.5mg/mL的單寧酸溶液。取50mL三角瓶，各加入30mL纖維素酶液，5mL單寧酸溶液，混合，放置15min后，利用紫外-可見分光光度計在220～320nm波長范圍內掃描，以緩沖溶液代替酶液作對照。各處理重復3次，記錄其紫外差示光譜。

1.3.3.2 單寧酸對木聚糖酶紫外光譜的影響

用0.1mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.5)配制質量濃度為4.7mg/mL木聚糖酶液和0.4、0.9、1.8、3.5mg/mL的單寧酸溶液。按上述方法繪制其紫外差示光譜。

1.3.4 單寧酸對酶熒光光譜的影響

1.3.4.1 單寧酸對纖維素酶熒光光譜的影響

用0.1mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.0)配制質量濃度為4.7mg/mL纖維素酶液和0.9、1.8、3.5、7mg/mL的單寧酸溶液。取50mL三角瓶，各加入30mL纖維素酶液、5mL單寧酸溶液，混勻，放置15min后，分別在λEX=278nm和λEX=295nm波長處掃描300～400nm的熒光淬滅光譜；以緩沖溶液代替酶液作對照。各處理重復3次，記錄其熒光光譜。

1.3.4.2 單寧酸對木聚糖酶熒光光譜的影響

用0.1mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH5.5)配制質量濃度為4.7mg/mL木聚糖酶液和0.4、0.9、1.8、3.5mg/mL的單寧酸溶液。按上述方法掃描300～400nm的熒光淬滅光譜，各處理重復3次，記錄其熒光光譜。

1.3.5 單寧酸的測定

單寧酸吸光度=A1－A2

式中：A1為單寧酸與酶反應的吸光度；A2為緩沖液中相同質量濃度單寧酸的吸光度。

1.4 統計分析

2 結果與分析

2.1 單寧酸對酶活力的影響

圖 1 不同質量濃度單寧酸對纖維素酶(a)和木聚糖酶(b)釋放還原糖的影響(n=3)Fig.1 Effect of different concentrations of tannic acid on the release of reducing sugars by cellulase and xylanase (n=3)

由圖1可知，單寧酸對纖維素酶具有抑制作用。這種抑制作用會隨著單寧酸質量濃度的升高而增大。當單寧酸質量濃度為1.00mg/mL時，抑制率就達到35.33%。同樣，單寧酸能抑制木聚糖酶的活力。這種抑制作用在單寧酸質量濃度為0.50mg/mL時達到最大，此時的抑制率為37.16%。當體系中單寧酸質量濃度超過0.50mg/mL時，還原糖質量濃度曲線會有所回升并趨于平緩。

2.2 單寧酸影響酶活性的動力學研究

表1 單寧酸對1mg/mL纖維素酶動力學參數的影響(±s，n=3)Table 1 Effect of different concentrations of tannic acid on kinetics parameters of cellulase(±s，n=3)

表1 單寧酸對1mg/mL纖維素酶動力學參數的影響(±s，n=3)Table 1 Effect of different concentrations of tannic acid on kinetics parameters of cellulase(±s，n=3)

項目CMC-Na質量濃度/(mg/mL)(mg/(mL·min))動力學方程Km/(mg/mL)反應速率/Vmax/(mg/(mL·min))1.000.19±0.01未加酚酸2.000.22±0.00 3.000.23±0.01 4.000.24±0.00 5.000.25±0.00 1/v=1.68×1/S+3.72(R2=0.9928)0.45±0.030.27±0.00 1.000.16±0.00單寧酸2.000.20±0.01 3.000.22±0.00 4.000.23±0.01 5.000.24±0.01 1/v = 2.51 × 1/S + 3.71(R2=0.9959)0.68±0.040.27±0.00

表2 單寧酸對1mg/mL木聚糖酶動力學參數的影響(±s，n=3)Table 2 Effect of different contractions of tannic acid on kinetics parameters of xylanase(±s，n=3)

表2 單寧酸對1mg/mL木聚糖酶動力學參數的影響(±s，n=3)Table 2 Effect of different contractions of tannic acid on kinetics parameters of xylanase(±s，n=3)

項目 木聚糖質量濃度/(mg/mL)(mg/(mL·min))動力學方程Km/(mg/mL)Vmax/(mg/(mL·min))反應速率/1.000.08±0.00未加酚酸2.000.15±0.00 3.000.21±0.01 4.000.26±0.01 5.000.32±0.01 1/v = 11.99 × 1/S + 0.77(R2=0.9996)15.62±0.30 1.30±0.02 1.000.09±0.00單寧酸2.000.14±0.01 3.000.18±0.01 4.000.22±0.00 5.000.27±0.01 1/v = 9.19 × 1/S + 2.27(R2=0.9869)4.05±0.54 0.44±0.03

如表1、2所示，單寧酸對纖維素酶具有競爭性抑制作用，表現為Km值顯著增大，而最大反應速率基本不變。這表明單寧酸能夠降低纖維素酶對底物的親和力，從而抑制纖維素酶活力。與纖維素酶相比，單寧酸抑制木聚糖酶活力，表現為最大反應速率和Km值均顯著減小，這說明單寧酸既能作用于游離的木聚糖酶，提高其親和力，又能與酶-底物復合物結合，降低酶反應速度，從而表現對木聚糖酶的抑制作用。

2.3 單寧酸對酶紫外差示光譜的影響

由圖2可知，纖維素酶和木聚糖酶的最大紫外吸收波長分別為280nm和278nm，這是由于色氨酸和酪氨酸等芳雜環對光的吸收。蛋白質分子中芳香族氨基酸殘基所處的微環境改變，會導致最大吸收波長的變化[11-12]。

圖 2 4 mg/mL纖維素酶(a)和木聚糖酶(b)的紫外吸收光譜Fig.2 Ultraviolet absorption spectra of 4 mg/mL cellulase and xylanase

圖 3 單寧酸對纖維素酶(a)和木聚糖酶(b)紫外差示光譜的影響Fig.3 Ultraviolet difference spectra of cellulase and xylanase before and after reaction with different concentrations of tannic acid

如圖3所示，纖維素酶的吸收峰強度會隨著單寧酸質量濃度增加而增大。當單寧酸質量濃度達到0.50mg/mL時，強度變化最大。同時，單寧酸會導致纖維素酶最大吸收波長藍移，且質量濃度越小，藍移程度越大，最大位移量為56nm。單寧酸質量濃度增加也會引起木聚糖酶的吸收峰強度增大。當單寧酸質量濃度高于0.13mg/mL時，強度變化較為明顯。與纖維素酶不同的是，木聚糖酶最大吸收波長的變化較為復雜：較高質量濃度的單寧酸會導致木聚糖酶最大吸收波長藍移，當質量濃度為0.50mg/mL時，最大藍移量為27nm；而較低質量濃度的單寧酸會使木聚糖酶最大吸收波長發生紅移，當質量濃度達到0.06mg/mL時，最大紅移量為50nm。

結果表明，添加單寧酸后，酶分子中色氨酸和酪氨酸等芳香族氨基酸殘基所處的微環境受到干擾，進而酶分子結構也發生改變。

2.4 單寧酸對酶的熒光淬滅作用

2.4.1 單寧酸對酶熒光淬滅光譜的影響

在蛋白質分子中存在色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基，它們含有苯環結構或共軛雙鍵，能吸收發射熒光，所以蛋白質具有內源熒光。但由于苯丙氨酸熒光極弱，對熒光有貢獻的只有酪氨酸和色氨酸[13-14]。

圖 4 單寧酸對纖維素酶熒光淬滅光譜的影響Fig.4 Fluorescence spectra of cellulase before and after being treated with different concentrations of tannic acid

由圖4可知，分別以278nm和295nm波長光激發時，纖維素酶的發射波長分別為340nm和337nm。隨著單寧酸質量濃度的增加，纖維素酶的熒光發射峰強度明顯減少。此外，單寧酸對纖維素酶內源光發射波長的影響較小。在激發波長為278nm和295nm時，單寧酸所引起的最大紅移量均為5nm。

由圖5可知，木聚糖酶在278nm和295nm波長光激發下，最大發射峰分別為354nm和356nm。而且木聚糖酶淬滅程度隨著單寧酸質量濃度的增加不斷增強，當單寧酸質量濃度達到0.50mg/mL時，熒光幾乎完全淬滅。同樣，木聚糖酶在單寧酸作用下最大發射波長基本不變，紅移量依次為3nm和5nm。

以上結果表明：添加的單寧酸與酶蛋白分子中的色氨酸和酪氨酸殘基發生相互作用，干擾了酶的構象，使上述2種氨基酸殘基所處的疏水環境發生了明顯變化。此外，不同波長激發時，熒光發射峰的強度也不同，278nm激發明顯強于295nm激發，這是因為前者會使色氨酸和酪氨酸同時受到激發，而后者只能激發色氨酸[15-16]。

圖 5 單寧酸對木聚糖酶的熒光淬滅光譜的影響Fig.5 Fluorescence spectrum of xylanase before and after being treated with different concentrations of tannic acid

2.4.2 單寧酸對酶的熒光淬滅機制

熒光淬滅過程實際上就是與發光過程相互競爭從而縮短發光分子激發態壽命的過程，可分為動態淬滅和靜態淬滅2種。動態淬滅是指淬滅劑和熒光物質的激發態分子之間發生相互作用(如：能量轉移或電子轉移)，產生瞬時的激態復合物，這些復合物可能不發射熒光，或者熒光的發射特性與原來的熒光物質不同，從而引起熒光淬滅現象。而靜態淬滅是淬滅劑和熒光物質分子在基態時發生配合反應，產生不發光的配合物。如果單寧酸對纖維素酶和木聚糖酶的熒光淬滅為動態淬滅，需滿足Stern-Volmer方程[15-16]，即：

式中：F0為無淬滅劑存在時熒光物質的熒光強度；F為淬滅劑存在時熒光物質的熒光強度；Kq為分子淬滅常數；τ0為無淬滅劑存在時物質的熒光壽命(生物大分子的熒光平均壽命約為10-8s[17])；Ksv為動態淬滅常數；[Q]為淬滅劑濃度。

選擇278nm波長光激發時的熒光光譜，以熒光光譜的相關數據做F0/F-[Q]圖，從中求出單寧酸分別與2種酶相互作用后的Kq，再與各類淬滅劑對生物大分子的最大擴散常數1.0×1010L/(mol·s)比較[17]。結果表明，2種酶的Kq均大于最大擴散常數，單寧酸對酶的熒光淬滅作用屬于靜態淬滅，即反應中形成了以非共價鍵結合的某種不發光的配合物。

表3 單寧酸淬滅酶熒光的Stern-Volmer方程Table 3 Parameters obtained from Sterm-Volmer equation after cellulase and xylanase reacted with tannic acids

由于單寧酸能與纖維素酶和木聚糖酶形成非熒光配合物，在此基礎上，進一步可得到兩者之間結合常數和結合位點數。按照靜態淬滅方程[17-18]。

式中：F0為無淬滅劑存在時熒光物質的熒光強度；F為淬滅劑存在時熒光物質的熒光強度；KA為靜態結合常數；[Q]為淬滅劑濃度；n為結合位點的數目。

表4 單寧酸淬滅酶熒光的靜態淬滅方程Table 4 Static quenching parameters of cellulase and xylanase after reaction with tannic acid

由表4所示，單寧酸與酶分子結合程度不同，木聚糖酶明顯高于纖維素酶。此外，上述2種酶與單寧酸之間均只有一個結合位點。

一般來講，多酚類物質對酶促反應的抑制作用是多方面因素共同作用的結果：1)酶的化學本質是蛋白質，酶與多酚結合生成不溶性的結合物，該結合物較酶的構型有所改變，從而造成酶活力的降低或喪失；2)對于以生物大分子為底物的酶促反應，多酚物質也可同底物結合，剝奪酶的催化底物或生成能降低酶活性的化合物[19]。

根據Haslam等[9]的研究發現，多酚會在蛋白質分子之間形成空間網狀結構，當反應體系中蛋白質質量濃度不同時，與多酚的結合方式也不同[20]。1)當多酚質量濃度遠大于蛋白質質量濃度時，多酚分子會在蛋白質分子表面形成單分子疏水層，其疏水性使多酚-蛋白質復合物沉淀析出；2)隨著蛋白質質量濃度升高，當其結合點數與多酚分子數目平衡時，形成多酚-蛋白質的網狀結構。理論上講，此時的沉淀量達到最大；3)當蛋白質質量濃度遠大于多酚質量濃度時，多酚-蛋白質的網狀結構被破壞，沉淀量會有所降低。

單寧酸對酶的抑制主要是由于單寧酸與酶的結合，即單寧酸對酶的抑制具有選擇性，這是因為多酚-蛋白質的結合反應本身是一種分子識別反應，2種反應物之間相互選擇[19]。因此，單寧酸對纖維素酶和木聚糖酶存在不同的有效抑制質量濃度。這種選擇性同樣表現在對于不同酶產生不同的抑制作用，單寧酸與纖維素酶結合，改變其構象，進而降低纖維素酶對底物的親和力；相反，單寧酸結合游離的木聚糖酶，促進其與底物的結合，同時又與酶-底物復合物結合，阻礙還原糖的釋放，從而達到抑制效果。

3 結 論

單寧酸對纖維素酶和木聚糖酶均具有抑制作用。其抑制效果分別在單寧酸質量濃度達到1.00、0.50mg/mL時達到最大，此時抑制率依次為35.33%、37.16%。此外，當木聚糖酶反應體系中的單寧酸超過最大抑制質量濃度時，其抑制效果會有所降低；若繼續添加，抑制效果基本保持不變。

動力學研究表明，單寧酸能夠通過不同方式降低兩種酶的活力。單寧酸能夠降低纖維素酶與底物的親和力，從而表現其對纖維素酶的競爭性抑制作用；而對木聚糖酶的抑制作用，表現為與酶-底物復合物結合，降低酶反應速度，引起還原糖釋放量的降低。

單寧酸能夠干擾酶蛋白分子的構象，使酪氨酸和色氨酸殘基所處的微環境發生明顯的變化，從而引起纖維素酶和木聚糖酶紫外差示光譜及熒光光譜的變化。酶紫外吸收峰強度會隨著單寧酸質量濃度增加而增大，但位移變化較為復雜：低質量濃度單寧酸分別會引起纖維素酶及木聚糖酶最大吸收波長的藍移(最大藍移量56nm)和紅移(最大紅移量50nm)；而高質量濃度單寧酸會導致木聚糖酶最大吸收波長藍移(最大藍移量27nm)。

熒光光譜結果表明，單寧酸質量濃度越高，對酶的熒光淬滅程度越強，且最大發射波長出現紅移現象，紅移范圍是3～5nm。這說明酶蛋白分子中的酪氨酸和色氨酸殘基與單寧酸結合。通過分析其對2種酶熒光淬滅作用的相關數據，證明單寧酸均能與酶分子的特定位點結合，形成穩定的配合物，從而影響其生物學功能；其結合部位應為芳香族氨基酸殘基，且只有一個結合位點。

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