海洋鏈霉菌GB-2產西索米星發酵條件優化

李金良，張 莉，李春燕，彭意開，王 穎，呂鳳霞，陸兆新*

(南京農業大學食品科技學院，江蘇 南京 210095)

西索米星(Sisomicin)是一種重要的氨基糖苷類抗生素，它的半合成化合物奈替米星(Natimicin)有高效低毒的特性，是氨基糖苷類抗生素中較理想的一個品種，應用廣泛[1-4]。目前國內生產的Sisomicin原料藥約占世界產量的80%以上[5]，采用的生產菌株主要是朱堅屏等[6]篩選得到的橄欖星孢小單孢菌無錫亞種和福州大學陳劍鋒等[7]采用的伊尼奧小單孢菌M.inyoensis F003。該兩種生產菌株皆為小單孢菌，目前國內外尚未發現小單孢菌以外的Sisomicin生產菌株，經多年菌種改造和發酵工藝優化[8-9]后仍不能完全滿足市場的需要。近年來在Sisomicin高產菌株篩選、菌種改造等方面的報道有所減少[10-11]，相反生產工藝的研究卻日趨成熟[12-13]，產量進一步提升的空間有限。因此，篩選新型、高產菌株有望突破限制Sisomicin生產能力進一步提升的瓶頸。

本實驗室從連云港海域潮間帶采集的樣品中篩選到1株具有高抑菌活性的鏈霉菌株——海洋鏈霉菌GB-2[14]，經分離純化鑒定，其抑細菌活性物質為Sisomicin[15-16]。這是首次發現小單孢菌以外的Sisomicin生產菌株，發酵液在121℃、紫外照射、pH1和pH12處理條件下抑菌活性基本不變[15]，具有重要的市場開發價值。

事實上，菌種選育和過程控制是提高次級代謝產物產量最常用的兩種手段[17-18]，在優勢菌株的基礎上通過對pH值、溫度、溶氧(DO)、培養基組分等條件的調控可以達到快速提高產量的目的。PB設計結合響應曲面法(RSM)[19]已被證明是一種快速、有效的統計篩選和復雜優化的技術手段，越來越廣泛地應用于抗生素[20]、工業用酶[21]和化學提取[22]等方面。本實驗通過響應面設計[23]優化海洋鏈霉菌GB-2產Sisomicin的發酵條件，確定主要響應因素的最佳水平和交互作用，以期達到提高產量、降低成本的目的，為工業化生產提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養基

海洋鏈霉菌GB-2 南京農業大學食品科技學院酶工程實驗室保藏[14]，原發酵條件下效價387.03U/mL。指示菌株短小芽孢桿菌(CMCC(B)63202)，購自中國科學院微生物菌種保藏中心。

供試菌株活化培養基：高氏一號合成培養基[14]；種子及原始發酵培養基：黃豆粉培養基[14]；指示菌株培養基：營養瓊脂培養基[14]；PB設計與RSM發酵培養基：按實驗設計配制。

1.2 培養方法

1.2.1 種子液制備

用接種環挑取2環活化好的斜面菌種到含有50mL種子培養基的250mL三角瓶中，28℃、180r/min振蕩培養48h，作為種子液。

1.2.2 發酵培養

將種子液以實驗設計接種量接入裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中，置于設定發酵條件下培養120h，發酵結束后放瓶備用。

1.2.3 指示菌的培養 將短小芽孢桿菌在營養瓊脂培養基斜面上活化，30℃培養14～18h，臨用前用生理鹽水清洗備用。

1.3 Sisomicin產量的測定

發酵液預處理：將培養好的發酵液置于10000r/min離心15min，取上清液過0.22μm微孔濾膜，4℃保存備用。

微生物效價檢定：采用杯碟法[24]，發酵優化階段效價采用一劑量法測定，原始效價與優化后效價采用三劑量法測定。

1.4 實驗設計

1.4.1 PB試驗篩選關鍵因子

從培養基和培養條件兩個方面考慮關鍵因子的選擇，玉米粉、黃豆粉、葡萄糖、酵母膏是常用的放線菌發酵原料，PB設計中量的確定由多次單因素試驗測得，發酵時間根據生產曲線確定，初始pH值參照發酵前后發酵液pH值變化確定，溫度、轉速、接種量為分析比較海洋鏈霉菌GB-2和小單胞菌M.inyoensis F003基本特性后確定。因此，在本實驗中所選擇的因素主要有：玉米粉、黃豆粉、葡萄糖、酵母膏、發酵時間、搖床轉速、接種量、起始pH值和發酵溫度，分別用X1～X9表示。發酵液預處理后經適當稀釋測定生物效價。以效價(titer)為響應值，每一自變量的低、高試驗水平分別以－1、1進行編碼。試驗設計和數據分析皆采用JMP軟件(version7.0，SAS Institute Inc.)，每組設2次重復，結果取平均值。因素編碼及自變量水平見表1。

表1 PB篩選設計試驗因子水平及編碼Table 1 Factors and levels for Plackett-Burman screening design

1.4.2 響應面試驗設計

根據PB設計的試驗結果與中心組合試驗(CCD)的設計原理[25-26]，分別用X1、X2、X3、X4表示黃豆粉、葡萄糖、溫度、搖床轉速。對于其他影響不顯著的參數，皆選定在低水平。發酵液預處理后適當稀釋進行生物效價測定。以效價為響應值，每一自變量的低、中、高試驗水平分別以－1、0、1進行編碼。試驗設計和數據分析皆采用Design-Expert軟件，每組設2次重復，結果取平均值。因素編碼及自變量水平見表2。

表2 中心旋轉設計試驗因素水平及編碼Table 2 Factors and levels for CCD

該模型通過最小二乘法擬合的二次多項方程為：

式中：Y為預測響應值；A0為常數項；Ai為線性系數；Aii為二次項系數；Aij為交互項系數；xi、xj為自變量編碼值。按照中心組合試驗設計的統計學要求，設2個中心點，需要進行26組試驗。

2 結果與分析

2.1 影響海洋鏈霉菌GB-2產Sisomicin關鍵因子的確定

表3 Plackett-Burman 設計與結果Table 3 Plackett-Burman design and results

PB的試驗方案及結果見表3，統計學分析表明該篩選模型顯著(P＜0.05)，影響海洋鏈霉菌GB-2產Sisomicin的主要因素是：黃豆粉(P=0.0015)、葡萄糖(P=0.00016)、轉速(P=0.0038)和溫度(P=0.000026)，此4個因素都在95%水平上差異顯著。玉米粉、酵母膏、發酵時間、接種量和pH值在95%水平上差異不顯著，說明其接近最優水平或者遠離試驗考慮范圍。因此，選擇黃豆粉、葡萄糖、溫度、轉速作為影響海洋鏈霉菌GB-2產Sisomicin的關鍵因素，其余因素皆選定為低水平進行后續響應面試驗。

2.2 響應面試驗設計及結果分析

2.2.1 海洋鏈霉菌GB-2產Sisomicin多元二次模型方程的建立及檢驗

根據PB試驗結果和中心組合試驗的設計原理，做四因素三水平的響應面分析，試驗設計及結果見表4，1～24是析因試驗，25、26是中心試驗，用來估計試驗誤差。

對表4的數據進行回歸擬合，可以得到效價對編碼自變量黃豆粉、葡萄糖、轉速和溫度的二次多項式方程：

從表5對模型的方差分析結果看，本實驗所選用的二次多項模型具有高度的顯著性(P＜0.0001)，失擬項在α=0.05水平上不顯著(P=0.1568＞0.05)，僅有約7.5%的實驗變異不能由該模型預測(R2Adj=0.9247)。從回歸方程各項的顯著性檢驗可以看出，轉速對Sisomicin效價的曲面效應顯著，黃豆粉、葡萄糖、溫度不顯著；葡萄糖和黃豆粉的交互作用影響顯著，其余均不顯著；葡萄糖、溫度、轉速的線性影響效應顯著。

表4 RSM設計方案及響應值的測定值Table 4 Expeirmental design and response results for RSM

表5 響應面二次多項模型及其各項的方差分析表Table 5 ANOVA for the response surface quadratic model

2.2.2 海洋鏈霉菌GB-2產Sisomicin響應面交互作用與優化

為確認黃豆粉質量濃度、葡萄糖質量濃度、溫度、搖床轉速4個因素對海洋鏈霉菌GB-2產Sisomicin交互作用的影響，根據上述回歸方程繪出響應面分析圖以及等高線圖。

圖 1 黃豆粉和葡萄糖質量濃度交互作用影響Sisomicin效價的響應面圖和等高線圖Fig.1 Response surface and contour plots for the effect of oybean flour and glucose concentration on sisomicin production

圖1顯示了在溫度和轉速位于中心水平時，黃豆粉和葡萄糖對海洋鏈霉菌GB-2產Sisomicin效價的響應面圖及等高線圖。可以看出此兩因素交互作用顯著[27-28]。葡萄糖與黃豆粉之間的比例變化會較大影響Sisomicin的產量，且兩者存在一定的協同作用，這說明合適的碳氮比(C/N)海洋鏈霉菌GB-2菌體生長和Sisomicin的合成需要控制合適的C/N。葡萄糖等速效碳源在低質量濃度時能夠促進菌株的生長，縮短調整期，但是在質量濃度較高時會引起菌體過量生長，其他營養物質耗盡而縮短發酵時間，過量部分葡萄糖又會導致pH值下降，對抗生素發酵產生抑制或阻礙作用[5,29]，這在本實驗中也得到了驗證。黃豆粉是大部分氨基糖苷類抗生素發酵生產時的主氮源，在低質量濃度時提高黃豆粉的量可以延長發酵時間從而實現高產。但是在本實驗室條件下搖瓶發酵時，黃豆粉質量濃度過高則會導致培養基會過于黏稠而影響氧氣傳遞，反而引起Sisomicin產量下降。

本實驗在分析4個影響因子時，發現僅有黃豆粉和葡萄糖交互作用顯著，其余因子之間交互作用皆不顯著，這與Adinaryanak[25]、Raza[29]等的報道不符，此兩位學者在相關優化研究中皆發現了4組交互作用顯著的因子。推測其原因可能為它們都是分析因子對發酵的影響，影響機理或作用機制相似，而非像本實驗中將培養基和培養條件一并進行分析。由此，本實驗可進一步推測海洋鏈霉菌GB-2在發酵生產Sisomicin時，培養基與培養條件之間不存在明顯的交互作用，即兩者變化互不影響。因此，在以后誘變株以及基因工程菌株優化時可以將培養基與培養條件分別進行優化以縮短研究時間，降低成本。

溫度對抗生素發酵影響顯著，過高或者過低都會影響菌株生長以及多種酶的活性，嚴重時甚至改變代謝途徑。朱堅屏等[30]在對橄欖星孢小單孢菌M-41發酵生產西索米星進行優化研究中發現在在33～35℃時可以達到一個較高發酵效價平臺，并建議在工業生產中溫度應該控制在(34±0.5)℃。這與本研究發現的28℃存在較大差別。海洋鏈霉菌GB-2自海洋中篩選得到[14]，適宜在常溫(25℃)條件下發酵，溫度過高不利于發酵進行，這是海洋鏈霉菌GB-2與小單孢菌的一個典型差別。

海洋鏈霉菌GB-2發酵生產Sisomicin是好氧發酵過程，成熟菌絲細成長鏈狀，搖床轉速過高或過低都會對Sisomicin發酵帶來不利影響，搖床轉速過低會導致通氣量不足，難以滿足正常生長需要，過高則會導致菌絲斷裂，菌的形態發生變化，改變了培養液的流變學特性，導致抗生素生物合成能力的下降。這與朱堅屏等[30]的報道相一致。

根據多元二次模型方程和因素顯著水平，計算出效價(Y)的最大值為726.11U/mL，此時Y值所對應的xi分別為x1=11.95，x2=2.96，x3=27.80，x4=183.43，即海洋鏈霉菌GB-2發酵產Sisomicin的最適搖瓶發酵條件為玉米粉20g/L、黃豆粉11.95g/L、葡萄糖2.96g/L、酵母膏2.5g/L、碳酸鈣1g/L、接種量5%、pH7.0、溫度28℃、搖床轉速183r/min(根據實際生產情況將轉速由理論值183.43r/min調整為實際值183r/min)、發酵時間120h，此時海洋鏈霉菌GB-2液體發酵上清液中Sisomicin的產量為726.11U/mL。

2.2.3 回歸模型的驗證實驗

為了檢驗模型預測的準確性在最佳發酵條件下進行3次平行實驗，所得發酵上清液中Sisomicin的產量平均為743.66U/mL，實驗值與理論值的相對標準偏差(RSD)僅為2.0792%，可見采用PB和RSM試驗可以很好地對海洋鏈霉菌GB-2發酵生產Sisomicin進行優化。

福州大學陳劍鋒等[7]采用的伊尼奧小單孢菌M.inyoensis F003發酵液中以純組分計Sisomicin質量濃度約為0.9～1.1g/L(相當于493.2～602.8U/mL)，優化后的海洋鏈霉菌GB-2發酵產Sisomicin效價已高于目前市場上正在使用的小單孢菌生產菌株，展現出了良好的工業應用價值。與工業上應用廣泛的伊尼奧小單孢菌發酵相比，還需繼續對海洋鏈霉菌GB-2進行育種改良[31-32]、工藝調控、無機鹽及微量元素調節和分子生物學[33-34]等方面的研究。

3 結 論

海洋鏈霉菌GB-2是除小單孢菌以外新型Sisomicin生產菌株。本實驗在PB篩選設計的基礎上，通過RSM法對關鍵因子以及它們之間的交互作用進行優化，得到了影響海洋鏈霉菌GB-2產Sisomicin的二次多項數學模型。通過分析得出，經過優化后最適搖瓶發酵條件為玉米粉20g/L、黃豆粉11.95g/L、葡萄糖2.96g/L、酵母膏2.5g/L、碳酸鈣1g/L、接種量5%、pH7.0、溫度28℃、搖床轉速183r/min、發酵時間120h，此時海洋鏈霉菌GB-2液體發酵上清液中Sisomicin的產量為726.11U/mL，與原發酵條件下效價387.03U/mL相比，產量提高了87.61%。

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