金黃色葡萄球菌噬菌體不敏感菌株的分離以及噬菌體JS01吸附位點(diǎn)的研究

賈靜靜，史 鋒,*，王利平，王小元

(1.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫 214122)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一種革蘭氏陽性致病菌，也是一種主要的食源性致病菌，在臨床上能夠引發(fā)心內(nèi)膜炎、骨髓炎、肺炎等疾病[1]；在食品加工過程中，易傳播，導(dǎo)致食物中毒[2]。據(jù)美國疾控中心報(bào)道，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒位居第2位，占整個(gè)細(xì)菌性食物中毒病例的33%，加拿大則高達(dá)45%。中國每年發(fā)生的此類中毒事件也非常多[3]。2008年4月3日，維維大亨高鈣奶粉因污染金黃色葡萄球菌而導(dǎo)致百名兒童中毒[4]。控制金黃色葡萄球菌的方法有物理法、化學(xué)法[5]，然而這些方法都不盡理想，而且金黃色葡萄球菌對(duì)抗生素的耐藥性越來越強(qiáng)[6]。因此，近年來利用特異性噬菌體控制金黃色葡萄球菌越來越受到研究者的關(guān)注。

當(dāng)噬菌體侵入金黃色葡萄球菌時(shí)，為了吸附到細(xì)胞上，會(huì)選擇細(xì)胞表面的一種成分作為其吸附的受體[7]，如磷壁酸、糖蛋白或者肽聚糖[8]。一種噬菌體的宿主范圍取決于它與宿主細(xì)胞表面受體之間的特異性吸附能力的大小。而吸附位點(diǎn)的特異性和吸附能力大小也影響著噬菌體對(duì)其宿主菌污染或感染的抑制效果。因此確定一種噬菌體與宿主菌相互作用時(shí)的吸附位點(diǎn)顯得尤為重要。對(duì)于大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的噬菌體來說，其吸附的受體已被詳細(xì)地報(bào)道[9]。例如：T系列噬菌體對(duì)大腸桿菌B菌株的吸附位點(diǎn)為細(xì)胞外膜蛋白OmpA[10]；λ系列噬菌體對(duì)大腸桿菌K12的吸附位點(diǎn)為細(xì)胞表面LamB蛋白等[11]。然而有關(guān)革蘭氏陽性菌噬菌體的吸附位點(diǎn)的報(bào)道則比較少。1969年，Chatterjee[12]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)金黃色葡萄球菌的磷壁酸結(jié)構(gòu)中缺乏N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)時(shí)，會(huì)對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性。Hill[13]的研究表明編碼乳酸菌細(xì)胞表面上噬菌體受體的基因發(fā)生了點(diǎn)突變，使受體結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，會(huì)對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性。直到2010年，Rosanna等[1]才確定了噬菌體M吸附金黃色葡萄球菌A170的位點(diǎn)為GlcNAc。受噬菌體侵染后出現(xiàn)的這種對(duì)噬菌體具有抗性的菌株被稱為噬菌體不敏感突變株(bacteriophage-insensitive mutant，BIM)。BIM菌株的出現(xiàn)一方面降低了噬菌體對(duì)宿主菌的裂解能力，會(huì)對(duì)病原菌的控制效果產(chǎn)生不利影響；另一方面可以大幅降低突變菌株的毒力，并保留其免疫原性，因此有望被開發(fā)成減毒疫苗而具有有利的應(yīng)用前景。

本實(shí)驗(yàn)室從環(huán)境中篩選到的噬菌體JS01裂解金黃色葡萄球菌ATCC25923時(shí)，產(chǎn)生并分離到了BIM菌株ATCC25923R，并對(duì)兩種菌株的菌落形態(tài)、生長狀況以及受噬菌體JS01的裂解情況進(jìn)行了對(duì)比，研究了ATCC25923和ATCC25923R的磷壁酸結(jié)構(gòu)的差異，確定了噬菌體JS01的吸附位點(diǎn)。這對(duì)于了解JS01與其宿主菌的相互作用并提高其抗菌性能具有積極的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

宿主菌金黃色葡萄球菌ATCC25923 中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)；金黃色葡萄球菌噬菌體不敏感菌株ATCC25923R以及噬菌體JS01由本實(shí)驗(yàn)室分離；TSB培養(yǎng)基(大豆肉湯培養(yǎng)基) 美國BD公司；蛋白胨、酵母膏 英國Oxoid公司；N-乙酰葡萄糖胺 美國BBI公司；辛基-瓊脂糖凝膠4FF 美國GE Pharmacia公司。

1.2 儀器與設(shè)備

THZ-300C型恒溫培養(yǎng)搖床 上海一恒科技有限公司；Operation Manual Rotavapor?RII旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 瑞士Büchi公司；Trace MS氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國菲尼根公司；Turbo Matrix TD熱脫附進(jìn)樣器 美國PE公司；DC-12氮吹儀 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)以及噬菌體的增殖

挑取單菌落接種至LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，以1：100的比例轉(zhuǎn)接至新鮮LB培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)。至OD600nm值為1.0后按一定的比例加入噬菌體，37℃振蕩培養(yǎng)至培養(yǎng)液澄清，離心，取上清液，用0.22μm水相微孔濾膜過濾后，保存在4℃冰箱中，以備使用。

1.3.2 噬菌體不敏感菌株的分離

金黃色葡萄球菌ATCC25923搖床培養(yǎng)至OD600nm值為1.0后，以MOI (即噬菌體數(shù)/初始細(xì)菌數(shù))為0.1的比例加入噬菌體，6h后取出100μL培養(yǎng)液，10倍梯度稀釋，取100μL涂布，37℃條件下培養(yǎng)24h，單菌落劃線純化3～5代后，得到的菌落即為噬菌體不敏感菌株，記作ATCC25923R，保存。觀察得到的BIM菌株的菌落形態(tài)，測(cè)定其生長狀況，以及噬菌體對(duì)其裂解狀況。

1.3.3 金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC25923R磷壁酸的提取與結(jié)構(gòu)分析

磷壁酸的提取參照Andreas等[14]提到的方法。得到的磷壁酸粉末1mg加入3mL 2mol/L三氟乙酸(TFA)溶解，封口，120℃烘箱中水解反應(yīng)2h，取出，減壓蒸干，加甲醇蒸干3次，重復(fù)操作以完全除盡TFA。水解后殘余物加入100mg NaBH4和2mL水，室溫條件下放置過夜進(jìn)行還原反應(yīng)。加入冰醋酸以除去過量的NaBH4，再于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮樣品至黏稠狀態(tài)，加入3～5mL甲醇-冰醋酸(5：1，V/V)，蒸干3次，繼續(xù)用甲醇蒸干2次，得到白色粉末，放入105℃烘箱加熱15min以除去水分。然后加入3mL乙酸酐，于101℃烘箱中乙酰化反應(yīng)1h，取出，多次加甲苯于50℃水浴減壓共沸蒸干至粉末狀。最后加適量水溶解粉末狀樣品，用氯仿萃取3次，合并氯仿層，水洗3次，分出氯仿層濃縮后進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜分析。氣相色譜-質(zhì)譜分析時(shí)，色譜柱為PB-5毛細(xì)管柱；程序升溫：150℃保持1min，以10℃/min升至280℃，保持6min；載氣(H2)流速0.8mL/min，進(jìn)樣量10μL；質(zhì)量掃描范圍m/z 35～400。

1.3.4 不同化合物對(duì)噬菌體裂解的影響

過夜培養(yǎng)金黃色葡萄球菌ATCC25923，以1：100的接種量轉(zhuǎn)接至20mL含有不同化合物的TSB培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm值為1.0，按MOI為0.1的比例加入噬菌體JS01，1h后測(cè)定培養(yǎng)液的OD600nm值。所測(cè)試的化合物包括0、5、10、20mmol/L的葡萄糖、GlcNAc，0μg/L和8μg/L的金黃色葡萄球菌ATCC25923、ATCC25923R磷壁酸(提取見1.3.3節(jié))。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體不敏感菌株的分離

噬菌體JS01裂解金黃色葡萄球菌ATCC25923的過程中，在裂解的初期，培養(yǎng)液中的活菌數(shù)會(huì)急速下降，隨著裂解時(shí)間的延長，菌體濃度上升(圖1A)，產(chǎn)生了噬菌體不敏感菌株(BIM)。于是從裂解后期的裂解液中分離出1株BIM菌株ATCC25923R(圖1C)。

圖 1 金黃色葡萄球菌ATCC25923噬菌體不敏感菌株的分離 Fig.1 Isolation of bacteriophage-insensitive mutant strain of S. aureus ATCC25923

2.2 金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC25923R的生長性能與噬菌體裂解性能

圖 2 ATCC25923R與ATCC25923菌株性質(zhì)對(duì)比Fig.2 Comparison between ATCC25923R and ATCC25923 strains

ATCC25923和ATCC25923R的生長曲線顯示，兩種菌株的生長基本一致，都是在12h后達(dá)到穩(wěn)定期(圖2A)。而從菌落形態(tài)上觀察，ATCC25923R(圖1C)比ATCC25923的菌落(圖1B)更大，邊緣光滑濕潤，顏色更深。噬菌體JS01對(duì)兩者的裂解能力也不同，將噬菌體JS01加入ATCC25923R的過夜培養(yǎng)液以后，菌體濃度(OD600nm值)繼續(xù)上升，ATCC25923R不能被噬菌體所裂解，而將JS01加入ATCC25923培養(yǎng)液后，OD600nm值會(huì)急速下降至0.278(圖2B)，菌液變澄清(圖2C)。說明噬菌體不敏感突變株ATCC25923R與出發(fā)菌ATCC25923相比，菌株發(fā)生了變化，因此進(jìn)一步分析金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC25923R表面的磷壁酸結(jié)構(gòu)。

2.3 金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC25923R表面的磷壁酸結(jié)構(gòu)差異

圖 3 ATCC25923R與ATCC25923磷壁酸的GC-MS圖譜Fig.3 GC-MS analysis of teichoic acid

從金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC25923R中提取磷壁酸，用GC-MS分析了兩菌株磷壁酸結(jié)構(gòu)的差異。GC-MS圖譜顯示(圖3)，ATCC25923R與ATCC25923的磷壁酸結(jié)構(gòu)中糖組分的主體衍生化物質(zhì)為六酰基-D-葡萄糖醇，對(duì)應(yīng)的出峰時(shí)間為13.88min，敏感菌ATCC25923中此成分的比例明顯高于非敏感菌。而在ATCC25923R菌株的磷壁酸結(jié)構(gòu)中，還多出一種物質(zhì)五酰基-戊糖醇，其出峰時(shí)間為11.03min，說明兩者的磷壁酸結(jié)構(gòu)存在著差異。

2.4 噬菌體的吸附位點(diǎn)分析

金黃色葡萄球菌ATCC25923R的菌落形態(tài)以及對(duì)噬菌體的敏感性與ATCC25923相比，發(fā)生了很大的變化，說明當(dāng)噬菌體吸附細(xì)菌時(shí)，細(xì)胞表面組成成分發(fā)生了變化，那么哪個(gè)成分可以作為噬菌體的受體？對(duì)此進(jìn)行了深一步的研究。

在ATCC25923對(duì)數(shù)期培養(yǎng)液中加入噬菌體JS01后，經(jīng)過1h，菌液變澄清，OD600nm值由1.0急速下降至0.278；而未加噬菌體的培養(yǎng)液OD600nm值則從1.0繼續(xù)增加至1.780(圖4)，說明噬菌體對(duì)ATCC25923有很好的控制效果。當(dāng)ATCC25923的培養(yǎng)液中含有20mmol/L GlcNAc時(shí)，加入噬菌體JS01作用1h后培養(yǎng)液的OD600nm值從1.0略降至0.695，明顯高于不含GlcNAc的對(duì)照(OD600nm=0.278)。說明由于GlcNAc的存在，一部分ATCC25923逃避了噬菌體JS01的吸附和裂解，即一部分噬菌體與GlcNAc這一底物相結(jié)合，而沒有與宿主菌表面受體相吸附，從而裂解金黃色葡萄球菌ATCC25923。隨著GlcNAc濃度的降低，培養(yǎng)液的OD600nm值相對(duì)于沒有加入GlcNAc的對(duì)照組的增加幅度不斷減少。說明GlcNAc參與噬菌體的吸附，因此它是噬菌體JS01裂解ATCC25923時(shí)的吸附位點(diǎn)。

圖 4 GlcNAc存在時(shí)噬菌體JS01對(duì)ATCC25923的裂解作用Fig.4 Lysis of ATCC25923 by phage JS01 in the presence of GlcNAc

在ATCC25923的培養(yǎng)液中添加20、10mmol/L或者5mmol/L葡萄糖時(shí)，JS01作用1h后培養(yǎng)液的OD600nm值分別降低0.276、0.256和0.284，與不含培養(yǎng)液的對(duì)照組(OD600nm=0.278)相接近(圖5)，即葡萄糖對(duì)噬菌體的裂解作用沒有任何影響，說明葡萄糖在噬菌體與宿主菌相互吸附的過程中沒有參與宿主菌的競(jìng)爭，也沒有加強(qiáng)噬菌體的裂解效果，因此葡萄糖不是噬菌體的吸附位點(diǎn)。

圖 5 葡萄糖存在時(shí)噬菌體JS01對(duì)ATCC25923的裂解作用Fig.5 Lysis of ATCC25923 by phage JS01 in the presence of glucose

最后本實(shí)驗(yàn)又測(cè)試了提取的A T C C 2 5 9 2 3 和ATCC25923R的磷壁酸對(duì)噬菌體JS01裂解效果的影響。當(dāng)培養(yǎng)基中添加8μg/L的ATCC25923或ATCC25923R的磷壁酸時(shí)，噬菌體作用1h后培養(yǎng)液的OD600nm值分別降低到0.276、0.302，與不含培養(yǎng)液的對(duì)照組(OD600nm=0.278)相接近(圖6)，而且不管是加入從ATCC25923菌株還是從ATCC25923R菌株提取出來的磷壁酸都沒有差異，說明細(xì)菌磷壁酸結(jié)構(gòu)的變化并沒有影響噬菌體對(duì)它的吸附作用，突變菌株的磷壁酸結(jié)構(gòu)中的主導(dǎo)成分沒有發(fā)生變化，同時(shí)也說明整個(gè)磷壁酸結(jié)構(gòu)不是噬菌體吸附ATCC25923的位點(diǎn)。

圖 6 磷壁酸存在時(shí)噬菌體JS01對(duì)ATCC25923的裂解作用 Fig.6 Lysis of ATCC25923 by phage JS01 in the presence of teichoic acid from ATCC25923 and ATCC25923R

3 討 論

金黃色葡萄球菌是一種食源性病源菌，利用特異性噬菌體控制金黃色葡萄球菌的污染和感染已成為食品安全領(lǐng)域和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的趨勢(shì)與重點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中的噬菌體JS01能夠快速有效地殺死金黃色葡萄球菌ATCC25923。然而，這種控制作用隨著時(shí)間的延長而效果減弱，ATCC25923發(fā)生突變，產(chǎn)生了噬菌體不敏感菌株ATCC25923R。突變菌株的菌落相比于出發(fā)菌株形態(tài)更大，顏色更深，同時(shí)對(duì)噬菌體JS01產(chǎn)生了抗性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，菌株對(duì)噬菌體產(chǎn)生抗性的原因有很多，例如：1)在噬菌體吸附時(shí)，金黃色葡萄球菌表面會(huì)形成一種蛋白質(zhì)A，這種蛋白質(zhì)與免疫球蛋白G結(jié)合，掩蓋噬菌體的吸附位點(diǎn)，而阻礙噬菌體的吸附[15]；2)噬菌體對(duì)莢膜包裹的金黃色葡萄球菌的裂解效果比對(duì)無莢膜的菌株明顯減弱，莢膜作為一種阻礙物阻止噬菌體與宿主菌表面吸附位點(diǎn)的結(jié)合[16]；3)一些二價(jià)陽離子如Ca2+、Mg2+能夠影響細(xì)菌表面所攜帶的靜電荷，從而影響噬菌體與細(xì)菌之間的碰撞而促進(jìn)噬菌體的吸附[17]等。本研究對(duì)敏感菌株ATCC25923和不敏感菌株ATCC25923R磷壁酸結(jié)構(gòu)的分析顯示，不敏感菌株的磷壁酸結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，這可能是導(dǎo)致兩者對(duì)JS01敏感性差異的一個(gè)原因，這還有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

一般來說，細(xì)菌是在紫外照射或噬菌體裂解時(shí)間延長時(shí)發(fā)生突變，產(chǎn)生噬菌體不敏感菌株BIM。但這種突變呈現(xiàn)一定的不穩(wěn)定性，有時(shí)突變細(xì)胞經(jīng)過多次的純化后，可以恢復(fù)對(duì)噬菌體的敏感性，因此不影響噬菌體作為一種醫(yī)療佐劑或者食品保護(hù)劑的抗菌效果[18]。鑒于噬菌體對(duì)人體的無毒性、安全性和可食性，使得它在治療病原菌感染和控制食源病菌的污染方面具有積極的應(yīng)用價(jià)值。而且最近的研究表明BIM菌株還有其他有益的用途。如在一個(gè)金黃色葡萄球菌BIM菌株A172中，13個(gè)與毒素有關(guān)的編碼基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)水平大幅度下降，致使菌株毒力降低。A172還能調(diào)節(jié)小鼠體內(nèi)TNF-α、IFN-γ、IL-1β基因的轉(zhuǎn)錄。更為重要的是，A172能夠有效地保護(hù)小鼠，免于受致死劑量的毒性菌株A170感染，因此提示出BIM菌株在免疫上的廣闊應(yīng)用前景[1]。

噬菌體吸附金黃色葡萄球菌時(shí)，其吸附位點(diǎn)可能是磷壁酸、肽聚糖或者糖蛋白。在本實(shí)驗(yàn)中，考察了當(dāng)葡萄糖、GlcNAc、磷壁酸存在時(shí)，噬菌體JS01對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923裂解效果的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有當(dāng)培養(yǎng)基中含有GlcNAc時(shí)，噬菌體裂解ATCC25923的效率才會(huì)下降，而且隨著GlcNAc濃度的提高，裂解效率下降程度增大；當(dāng)培養(yǎng)基中含有葡萄糖時(shí)，裂解效率與對(duì)照組保持一致；在培養(yǎng)基中加入ATCC25923和ATCC25923R菌株的磷壁酸時(shí)，裂解效率不變，表明只有GlcNAc是噬菌體JS01的吸附位點(diǎn)。這些研究為揭示噬菌體JS01的裂解機(jī)制和受體位點(diǎn)及其應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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