活的非可培養狀態大腸桿菌O157:H7的復蘇研究

田 聰，余以剛，肖性龍*，李建龍，吳 暉

(華南理工大學輕工與食品學院，廣東 廣州 510640)

細菌的活的非可培養狀態(viable but nonculturable state，VBNC)是活菌的一種特殊存在狀態，細菌在外界環境壓力條件下，失去在常規培養基生長繁殖的能力，但是仍然具有代謝活性，在一定的條件下能夠復蘇。VBNC菌的一個重要特征是復蘇，只有細胞能夠提高代謝活性并且恢復可培養性才能夠有效證明VBNC狀態是細菌保留活性的一種形式。目前的研究結果并不能將所有的VBNC菌都復蘇，復蘇是一個復雜的過程，并非直接去除誘導因子即能實現[1]。

大腸桿菌O157：H7(Escherichia coli O157：H7)是一種常見的食源性致病菌，能夠通過食物和水源傳播，對人類的安全構成威脅[2]。當遇到如低溫、高滲透壓、pH值、紫外線輻射和改變營養等不良環境條件時，E.coli O157：H7會進入VBNC[3]，細菌在這種狀態下仍然具有新陳代謝活性，保留毒性基因，但是常規方法無法培養，造成漏檢[4]，許多VBNC菌在合適的外界條件下可以實現復蘇[5]。

目前對于VBNC的復蘇研究普遍集中在弧菌上，對于VBNC狀態的大腸桿菌復蘇研究較少[6]。E.coli O157：H7在低溫寡營養條件下誘導21d后進入VBNC狀態，通過在平板培養基中加入過氧化氫酶或者丙酮酸鹽等物質，2d內平板計數增加到104～105CFU/mL，研究者[7]認為通過添加的物質能夠降解代謝副產物H2O2，促進細胞恢復活性達到復蘇的目的，而不是通過提供細胞培養所需要的營養物質恢復可培養能力。

Ohtomo等[8]利用高鹽環境誘導E.coli CE273進入VBNC狀態，菌落數在19h內減少90%，當解除壓力環境后，細胞在2h內恢復可培養性，菌落數達到誘導前濃度。Pinto等[9]首次利用在基本培養基中加入氨基酸或者改變溫度的方法，使得4℃條件下誘導的E.coli成功復蘇。對于大腸桿菌的不同株型的VBNC菌的復蘇方法并不相同，復蘇的差異性和復雜性使得復蘇條件的篩選顯得尤為重要。

目前對VBNC狀態E.coli O157：H7復蘇研究較少，本實驗研究低溫因素對其VBNC狀態誘導的作用，對不同復蘇條件進行篩選，結合利用熒光定量PCR與熒光顯微鏡觀察等方法，探討E.coli O157：H7的復蘇能力。本實驗利用常規簡便的復蘇方法，對誘導進入VBNC狀態的E.coli O157：H7體外復蘇，復蘇實驗成功同時可以作為VBNC狀態誘導成功的佐證。

1 材料與方法

1.1 菌株與培養條件

大腸桿菌E.coli O157：H7(ATCC6589)，為本實驗室保存菌種。

細菌培養采用LB液體培養基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化鈉10g/L，pH值調至7.0，培養基經過121℃、20min滅菌后使用。E.coli O157：H7接種到LB液體培養基中，37℃、180r/min搖床過夜培養至對數生長期(OD600nm≈1.0)。液體培養基中添加1.8g/100mL的瓊脂粉即固體培養基，用于平板法測可培養菌數。

1.2 試劑與儀器

吖啶橙、蘇丹黑 美國Amresco公司；萘啶酮酸、酵母膏、吐溫-80 美國Sigma公司；細菌基因組DNA快速提取試劑盒 北京艾德萊生物科技有限公司；PCR Amplification Kit 日本TaKaRa公司；革蘭氏染色液 廣東環凱微生物科技有限公司。

紫外分光光度計、臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；Milli-Q Academic超純水系統 美國Millipore公司；Olympus CX-31落射熒光顯微鏡 日本奧林帕斯公司；ABI7500熒光定量PCR儀器 美國應用生物系統公司。

1.3 方法

1.3.1 VBNC狀態E.coli O157：H7的誘導

將過夜培養后處于對數成長期的E.coli O157：H7采用平板計數法測得菌液濃度為109CFU/mL。菌懸液8000×g離心2min，用無菌水重懸，接入30mL誘導液中，加入無菌水調整細菌濃度達到106CFU/mL左右。誘導液為：LB液體培養基(－18℃)和生理鹽水溶液(－18℃)。誘導過程中定期每隔2d用平板計數法、吖啶橙熒光顯微鏡計數法(acridine orange direct count，AODC)和活菌直接計數法(direct viable count，DVC)定量檢測可培養菌數、總菌數和活菌數的變化，設3次平行實驗。

1.3.2 復蘇條件的篩選

取3mL誘導結束剛進入VBNC狀態的E.coli O157：H7于8000×g離心2min，用無菌水重懸，接入3mL無菌水中，分別用4種方法復蘇。同時取3mL無菌Milli-Q水作為陰性對照組。

寶劍遞出去的那一瞬間，奇怪的事情發生了——對方不避不擋,只是留給了岳無影一個平靜的微笑，微笑中充滿了對生的眷戀和對死亡的坦然接受。

1)直接升溫復蘇：VBNC菌液直接置于37℃恒溫培養箱中200r/min振蕩培養，2d后平板計數。

2)添加營養物質升溫復蘇：VBNC菌液中加入體積分數為25%無菌酵母浸膏，25℃、180r/min培養，2d后平板計數。

3)添加化學物質升溫復蘇：VBNC菌液中加入體積分數為8%無菌吐溫-80，37℃、200r/min培養，2d后平板計數。

4)熱激復蘇：VBNC菌液置于45℃水浴15s，恢復室溫后平板計數。

1.3.3 熒光顯微鏡觀察

VBNC狀態菌的誘導和檢測以及復蘇過程用AODC和DVC法分別檢測細菌總數和活菌總數，同時用熒光顯微鏡觀察不同時期的細菌細胞形態。從誘導環境中取菌液10倍稀釋，取合適濃度的菌液1mL于8000×g轉速條件下離心2min，用無菌水重懸。洗滌后的菌液中加入100μL的1g/L吖啶橙溶液，暗處染色5min。吸取10μL染色完畢的菌液，均勻地滴在置于無自發熒光的載玻片中心處微孔濾膜上，微孔濾膜之前用2g/L的蘇丹黑溶液染色以去除背景熒光。制成的樣本用落射熒光顯微鏡觀察結果[10]。當可培養數降為0時，連續檢測3d仍為0，DVC檢測顯示有活菌存在時，認為誘導環境中的菌體進入VBNC狀態。取對數生長期的正常活菌作為對照組進行熒光觀察。復蘇成功后采用相同的方法檢測，并進行熒光觀察。

1.3.4 細菌DNA提取及實時熒光定量PCR檢測

取500μL菌液10000×g離心3min收集菌體，采用細菌基因組DNA快速提取試劑盒提取DNA，得到終體積為50μL的PCR反應模板。

利用ABI 7500 Real Time PCR System檢測。E.coli O157：H7上游引物5’-CTACAGGTGAAGGTGGAATGGT-3’(22bp)，下游引物5’-GTAGCCTATAACGTCATGCCAAT-3’(2 3 b p)，以 及T a q M a n 水 解 探 針5’-F A MTCACGAATGACAAAACACTTTATGAC-BHQ1[11]。PCR擴增反應體系為25μL：10×(NH4)2SO4Buffer 2.5μL，25mmol/L MgCl23.5μL，上下游引物各1μmol/L，探針0.5μmol/L，25mmol/L dNTPs 1μL，Taq DNA聚合酶0.5μg/μL，DNA模板2μL，補加無菌水至25μL。PCR反應條件為：95℃預變性5min；95℃、5s，60℃、40s(收集熒光)，進行40個循環；反應結束后40℃保溫。3次平行實驗，計算平均循環閾值(Ct)和樣本標準差。

2 結果與分析

2.1 VBNC狀態誘導

改變溫度是誘導VBNC菌的常用方法，不同細菌對于低溫的耐受性不同，當有其他不利因素，如寡營養協同誘導時，有利于細菌形成VBNC狀態。初始濃度為6.5×106CFU/mL的E.coli O157：H7菌液于低溫(－18℃)的作用下分別在富營養(LB液體培養基)和寡營養(生理鹽水)環境條件下誘導，可培養數分別在誘導的第15天和第18天降為0。同時，通過AODC法檢測的總菌數在整個誘導過程中保持穩定，而DVC法測得的活菌數緩慢降低，至誘導結束時活菌數分別下降1～2個數量級(圖1)，即進入VBNC狀態。說明兩種環境均能夠誘導E.coli O157：H7進入VBNC狀態，低溫是VBNC狀態的E.coli O157：H7誘導的重要影響因子。E.coli的活性與溫度相關是因為低溫能夠導致新陳代謝活性的減弱，可以延緩對于細胞的損害[12]，低溫有利于E.coli進入VBNC狀態[13]。同時，結果顯示在低溫條件下營養條件對于E.coli O157：H7的VBNC狀態誘導影響不大。

圖 1 E.coli O157:H7在LB培養基和生理鹽水中的菌數變化Fig.1 Change in cell counts of E. coli O157: H7 in LB broth and physiological saline

2.2 VBNC狀態E.coli O157：H7的復蘇

2.2.1 平板計數法驗證復蘇

對于低溫寡營養方法誘導的VBNC菌，去除誘導時的不利環境因子，提高溫度和添加營養物質可能會使VBNC菌復蘇。取剛進入VBNC菌株進行復蘇，2d后經檢測結果顯示，升溫、添加25%酵母浸膏和添加8%吐溫-80均能夠使VBNC菌恢復可培養狀態(表1)。通過涂布平板發現，平板上長出的單菌落比正常的單菌落略小，可能與VBNC狀態下細菌細胞縮小有關。復蘇后的濃度達到105CFU/mL左右，比誘導前的細菌濃度106CFU/mL低1個數量級，重復實驗得到相同的結果。細菌進入VBNC狀態15d后，采用相同的方法復蘇，4種方法均不能使VBNC菌恢復可培養性。說明E.coli O157：H7只能維持VBNC一段時間，之后便會進入死亡期[14]，實驗結果證明細菌VBNC狀態的誘導和維持時間可能與誘導環境和細菌自身對于環境的抵御適應能力有關。VBNC狀態的復蘇與誘導方法、復蘇條件選擇和VBNC狀態的誘導和維持時間有關，是一個復雜的過程。

表1 VBNC狀態E.coli O157:H7復蘇結果Table 1 Resuscitation of VBNC E. coli O157:H7

2.2.2 熒光顯微鏡驗證復蘇

圖 2 不同狀態E.coli O157:H7熒光圖像(標尺為10μm)Fig.2 Fluorescence images of E. coli O157:H7 at different states (bar represents 10 μm)

圖2為不同狀態下E.coli O157：H7的熒光顯微圖像。菌懸液經過吖啶橙染色后，經熒光顯微鏡觀察，發現誘導后進入VBNC狀態的菌體變小，縮小接近于球狀，正常菌體為桿狀，菌體比較大。經過吸收營養處理的VBNC菌體染色后經熒光顯微鏡觀察，部分菌體體積增大1～2倍左右，認為是VBNC狀態細菌，少數細菌體積不變，認為是死菌。DVC法使用萘啶酮酸抑制DNA復制，在營養物質作用下，活細胞只生長不分裂，可以通過染色后觀察從而實現對活菌的檢測[15]。復蘇后的E.coli O157：H7經過AODC法處理后，菌體形態和大小與正常菌體基本相同。

2.2.3 熒光定量PCR檢測結果

利用熒光定量PCR技術檢測兩種誘導環境中E.coli O157：H7在正常狀態、VBNC狀態和復蘇后的菌數變化，不同狀態下的樣本Ct值略有不同。由圖3可知，E.coli O157：H7從誘導到復蘇整個過程中，總菌數變化不大，VBNC狀態時總菌數略有降低，與AODC法檢測結果相同。同時，熒光定量PCR結果證明復蘇后通過平板法檢測到的菌落不是雜菌污染，進一步證實了復蘇成功。

圖 3 熒光定量PCR檢測不同狀態下的E.coli O157:H7Fig.3 qPCR detection of E. coli O157: H7 at different states

3 結 論

菌液濃度為106CFU/mL的E.coli O157：H7分別在富營養和寡營養以及－18℃低溫的作用下，15d和18d內分別進入VBNC狀態，37℃直接升溫復蘇、25℃加入25%酵母液和37℃加入8%吐溫-80均能在2d內使VBNC狀態E.coli O157：H7復蘇，可培養菌數到達104～106CFU/mL，接近于誘導前濃度。對于VBNC菌的檢測結合了平板計數法、熒光顯微鏡觀察法和熒光定量PCR技術，有效、快速、準確地驗證實驗結果，克服了傳統平板計數法對于VBNC菌的漏檢缺陷。

[1] ROWAN N J. Viable but nonculturable forms of food and waterborne bacteria： Quo Vadis?[J]. Trends in Food Science & Technology, 2004, 15： 462-467.

[2] CHALMERS R M, AIRD H, BOLTON F J. Waterborne Escherichia coli O157：H7[J]. J Appl Microbiol, 2000, 88(Suppl 1)： 124-132.

[3] MAROUANI G N, OLIVIER F, DANIELLE C, et al. Potential of Escherichia coli O157：H7 to persist and from viable but non-culturable cells on a food-conduct surface subjected to cycles of soiling and chemical treatment[J]. International Journal of Food Microbiology, 2010, 144(1)： 96-103.

[4] OLIVER J D. Recent findings on the viable but nonculturable state in pathogenic bacteria[J]. FEMS Microbiol Rev, 2010, 34： 415-425.

[5] KEEP N H, WARD J M, ROBERTSON G, et al. Bacterial resuscitation factors： revival of viable but non-culturable bacteria[J]. Cellular and Molecular Life Sciences, 2006, 63： 2555-2559.

[6] WHITESIDES M D, OLIVER J D. Resuscitation of Vibrio vulnifi cus from the viable but nonculturable state[J]. Appl Environ Microbiol, 1997, 64： 3025-3028.

[7] MIZUNOE Y, SUN N W, TAKADE A, et al. Restoration of culturability of starvation-stressed and low-temperature-stressed Escherichia coli O157 cells by using H2O2-degrading compounds[J]. Arch Microbiol, 1999, 172： 63-67.

[8] OHTOMO R, SAITO M. Increase in the culturable cell number of Escherichia coli during recovery from saline stress： possible implication for resuscitation from the VBNC state[J]. Microb Ecol, 2001, 42： 208-214.

[9] PINTO D, ALMEIDA V, SANTOS M A, et al. Resuscitation of Escherichia coli VBNC cells depends on a variety of environmental or chemical stimuli[J]. Journal of Applied Microbiology, 2011, 110： 1601-1611.

[10] 李影, 段銳, 錢愛東, 等. “活的非可培養狀態”細菌熒光觀察方法[J]. 生物技術, 2010, 20(3)： 66-68.

[11] ELIZAQUíVEL P, GABALDóN J A, AZNAR R. Quantification of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157：H7 in non-spiked food products and evaluation of real-time PCR as a diagnostic tool in routine food analysis[J]. Food Control, 2011, 22： 158-164.

[12] INéS A, ALICIA M, MAITE O, et al. Effect of temperature and starvation upon survival strategies of Pseudomonas fuorescens CHA0： comparison with Escherichia coli[J]. FEMS Microbiol Ecol, 2010, 74： 500-509.

[13] KOCH A L. The adaptive responses of Escherichia coli to a famine and feast existence[J]. Adv Microb Physiol, 1971, 6： 147-217.

[14] 岳秀娟, 余利巖, 張月琴. 自然界中處于VBNC狀態微生物的研究進展[J]. 微生物學通報, 2004, 31(2)： 108-111.

[15] KOGURE K, SIMIDU U, TAGA N. A tentative direct microscopic method for counting living marine bacteria[J]. Can J Microbiol, 1979, 25： 415-420.