低分子質量殼聚糖對鎘脅迫引起河南華溪蟹氧化損傷的保護作用

樊冰心，任國銳，李瑞金，王 蘭,*

(1.山西大學生命科學學院，山西 太原 030006；2.山西大學環境科學與工程研究中心，山西 太原 030006)

鎘可以通過食物鏈傳遞進入動物體內，誘導機體產生大量活性氧自由基而形成氧脅迫，使機體抗氧化體制失衡，進而對機體造成損傷[1-2]。急性或慢性鎘的作用會對動物器官尤其是肝臟產生明顯損傷或危害。低分子質量殼聚糖(low molecular weight chitosan，LMWC)具有非常好的抗氧化、提高免疫、促生長和保護肝臟等諸多功能[3-5]。本課題組前期研究已發現，LMWC可以有效清除華溪蟹體內的自由基，提高其非特異性免疫，降低機體內氧化損傷程度[6]。近年來，LMWC抗氧化功能的研究越來越受到研究者的重視。鑒于此，本實驗就LMWC和鎘獨立及共同作用下河南華溪蟹肝胰腺組織中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽硫轉移酶(GST)活性、丙二醛(MDA)和谷胱甘肽(GSH)含量以及鎘積累的變化規律進行研究，旨在探討LMWC對鎘引起氧化損傷的防護機制，為更好地利用殼聚糖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

河南華溪蟹，于2011年9月購自太原市五龍口水產批發市場，置實驗室水族缸(45cm×30cm×30cm)暫養2周以上后待用。養殖所用水為曝氣48h的自來水，水溫16～20℃，pH7.5，溶氧量8.0～8.3mg/L。每日換水1次，并及時清理缸內排泄物，每周投喂飼料3次。

低分子質量殼聚糖(≤5000D，灰分0.87%，細度80目) 浙江金殼甲殼生物公司；MDA、SOD、GSH和GST試劑盒 南京建成生物工程有限公司；氯化鎘(CdCl2·2.5H2O)為分析純。

1.2 儀器與設備

SpectraMax M5多功能酶標儀 美國分子儀器公司；Varian AA 240FS火焰原子吸收儀 美國安捷倫公司；MR 23低溫冷凍離心機 美國Thermo公司；MM-49647-00電動勻漿器 德國Fluko公司；XW-80A漩渦混合器 上海棱譜儀器儀表有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠；CPA225D電子天平 德國賽多利斯公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗設計

通過鎘對河南華溪蟹的急性毒性實驗，由概率單位法求得96h時LC50為232.00mg/L[7]。根據LC50的12.5%、25%和37.5%實驗設置3個鎘處理組(A、B、C組)：29、58、87mg/L，3個LMWC組(D、E、F組)：20、40、80mg/L，鎘(58mg/L)與3個不同質量濃度(20、40、80mg/L)LMWC聯合作用組(G、H、I組)，同時設對照組，每組設4個平行，處理時間96h。

隨機選取60只健康、靈敏且體質量基本一致的河南華溪蟹個體(體質量(20.0±0.5)g)隨機分成10組，置處理缸(45cm×30cm×30cm)中，每缸加2L曝氣48h的自來水。鎘處理組：首先將氯化鎘配制成母液，再稀釋至各實驗質量濃度；LMWC組：根據不同質量濃度加入不同量的LMWC；鎘和LMWC聯合作用組：加入一定體積的氯化鎘母液和不同量的LMWC。處理期間不喂食。

1.3.2 樣品制備

將蟹體放在冰盤上活體解剖，迅速取出肝胰腺組織，其中一部分用于測定SOD、MDA、GST和GSH。具體方法：稱質量后按1：10(m/V)加入預冷的生理鹽水，電動勻漿器勻漿(冰上操作)，將勻漿液4℃、4000r/min條件下離心15min，取上清液，－80℃冷凍備用；另一部分用于測定鎘積累量，具體方法：在肝胰腺組織中加入混合酸液(高氯酸與濃硫酸的體積比為1：3)過夜，置電熱板上，120℃消化4h左右，至棕色氣體消失，得到透明溶液。如消化過程樣品發生炭化則需補加相同比例的混酸，冷卻后消化得到透明溶液用超純水定容至10mL。

1.3.3 指標測定

SOD、GST活性及GSH、MDA含量和蛋白質水平采用南京建成生物工程有限公司試劑盒說明進行具體操作，鎘積累量用火焰原子吸收儀測定。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 鎘單獨處理和LMWC與鎘聯合作用對河南華溪蟹肝胰腺組織鎘積累的影響

圖 1 鎘單獨處理和LMWC與鎘聯合處理96h鎘在河南華溪蟹肝胰腺組織中的積累Fig.1 Accumulation of Cd2+ in hepatopancreas of S. henanense exposed to Cd2+ alone or to both LMWC and Cd2+ for 96 h

由圖1可知，鎘在河南華溪蟹肝胰腺組織中的積累隨著質量濃度的增加逐漸升高，且3個劑量組與對照組相比均表現出顯著或極顯著性差異(P＜0.05或P＜0.01)；與58mg/L鎘組相比，鎘積累隨著LMWC濃度的升高逐漸降低，且在80mg/L時表現出顯著性差異(P＜0.05)。

2.2 鎘或LMWC作用下河南華溪蟹肝胰腺組織SOD活性的變化

圖 2 鎘或LMWC處理96h SOD活性在河南華溪蟹肝胰腺組織中的變化Fig.2 SOD activity in hepatopancreas of S. henanense exposed to Cd2+or LMWC for 96 h

由圖2可知，與對照組相比，用鎘染毒96h，河南華溪蟹肝胰腺組織SOD活性顯著下降，呈現顯著性差異(P＜0.05)。但是，LMWC對SOD活性的變化并未表現出顯著性差異。

2.3 鎘或LMWC作用下河南華溪蟹肝胰腺組織MDA含量的變化

圖 3 鎘或LMWC處理96h MDA含量在河南華溪蟹肝胰腺組織中的變化Fig.3 MDA content in hepatopancreas of S. henanense exposed to Cd2+or LMWC for 96 h

由圖3可知，與對照組相比，鎘處理組的河南華溪蟹肝胰腺組織MDA含量顯著增加，呈現顯著性差異(P＜0.05)。但是，LMWC對MDA含量的變化并未表現出顯著性差異。

2.4 鎘單獨處理和LMWC與鎘聯合作用對河南華溪蟹肝胰腺組織GSH含量的影響

圖 4 鎘單獨處理和LMWC與鎘聯合處理96h GSH含量在河南華溪蟹肝胰腺組織中的變化Fig.4 GSH content in hepatopancreas of S. henanense exposed to Cd2+alone or to both LMWC and Cd2+ for 96 h

由圖4可知，GSH在河南華溪蟹肝胰腺組織中的含量隨著質量濃度的增加逐漸降低，且3個質量濃度組與對照組表現出顯著性差異(P＜0.05)；與58mg/L鎘組相比，GSH含量隨著LMWC質量濃度的升高逐漸升高，且在80mg/L時表現出顯著性差異(P＜0.05)。

2.5 鎘單獨處理和LMWC與鎘聯合作用對河南華溪蟹肝胰腺組織GST活性的影響

圖 5 鎘單獨處理和LMWC與鎘聯合處理96h GST活性在河南華溪蟹肝胰腺組織中的變化Fig.5 GST activity in hepatopancreas of S. henanense exposed to Cd2+alone or to both LMWC and Cd2+ for 96 h

由圖5可知，GST在河南華溪蟹肝胰腺組織中的活性隨著染毒質量濃度的增加逐漸降低，且在58mg/L和87mg/L時相對于對照組表現出顯著性差異(P＜0.05)；與58mg/L鎘組相比，GST活性隨著LMWC質量濃度的升高逐漸升高，且在80mg/L時表現出顯著性差異(P＜0.05)。

3 討 論

3.1 鎘在河南華溪蟹肝胰腺組織的積累及其脂質過氧化作用

肝胰腺組織是甲殼動物重要的解毒器官，在消除外來有毒物質對生物機體毒害影響方面起著重要作用，同時它也是主要的消化器官，是營養物質消化、吸收和貯存的主要場所，生理代謝活動的中心，更是重金屬積累的主要器官[8]。自由基介導的生物體內的氧化損傷是重金屬毒性效應的重要體現，脂質過氧化是這種氧化損傷的一種主要形式[9]。SOD是一種以自由基為底物的抗氧化酶，能有效清除超氧陰離子自由基，是生物體內防御氧化損傷的一種非常重要的金屬酶。MDA作為脂質過氧化的終產物，能夠很好地反應生物體過氧化脅迫的程度。本實驗研究發現，鎘處理后，河南華溪蟹肝胰腺組織中鎘的積累量隨著質量濃度的增加逐漸增加，58mg/L鎘引起SOD活性顯著下降，MDA含量顯著上升，提示鎘不僅能在溪蟹肝胰腺組織內積累，并可引起脂質過氧化。

3.2 低分子質量殼聚糖對鎘脅迫下河南華溪蟹肝胰腺組織的保護作用

LMWC具有純天然活性及無毒副作用，有研究報道LMWC用于水產養殖可以促進水生動物的生長，對水產養殖起到保護作用[10-11]。本課題組前期研究已發現LMWC與鎘聯合作用可以使華溪蟹肝胰腺組織SOD活性升高和MDA含量降低[12]，LMWC能提高鎘脅迫下機體的抗氧化能力。本研究結果表明，在LMWC單獨作用下沒有引起SOD活性和MDA含量的顯著變化，說明LMWC單獨作用不會引起河南華溪蟹肝胰腺組織脂質過氧化，不會對華溪蟹的生長帶來負面影響。同時，在鎘處理下肝胰腺組織中鎘的積累量隨著質量濃度的增加逐漸增加，但是，在80mg/L LMWC和鎘的聯合作用下，鎘的積累量顯著下降。LMWC引起鎘在肝胰腺組織積累量下降的原因可能是：1)LMWC是自然界中唯一的一種堿性多糖，水溶性好，其本身具有較多的活性基團(氨基、羥基)，這些活性基團可以與重金屬有效結合起到去除重金屬的作用和良好的解毒作用[13-15]，大量的鎘在華溪蟹體外被絡和，進入體內的量會減少，鎘在機體內的積累和毒性明顯降低。2)LMWC對肝胰腺組織的保護作用。通常，當外來毒物對華溪蟹造成脅迫時，肝胰腺組織自身有一定的解毒作用。GSH屬于含有巰基的、小分子肽類物質，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的三肽。GSH作為一種解毒物質，通常在肝胰腺組織中含量最高[16]。GSH對機體中活性氧自由基的清除起著重要的作用，GSH含量的變化可以靈敏地反映機體解毒能力強弱[17]。GSH中半胱氨酸上的巰基為活性基團可以和重金屬絡合，以巰基-鎘的形式將鎘排出體外，從而起到解毒的作用；同時GSH作為體內一種重要的抗氧化劑，其本身也極易被氧化，可起到保護蛋白質和酶等分子中巰基不被自由基等毒物氧化，從而使蛋白質和酶發揮其本來的功能[18]。GST廣泛存在各種生物組織中，是一種小分子的水溶性蛋白，在機體受到氧化損傷后起著重要的作用[19]。GST可以催化體內的或者外來入侵的有害物質的親電子基團與GSH中的巰基結合，增強有害物質的疏水性，且易于機體生理排泄，從而達到解毒的目的[20]；此外，GST也可以通過修復自由基引起的細胞膜磷脂損傷來抑制氧化反應的發生，從而發揮其抗氧化作用[21]。GSH水平和GST活性的下降，意味著組織解毒能力下降。可見當外界有毒物質大量入侵時，GSH含量的多少和GST活性的高低對機體的解毒能力和抗氧化能力起到非常重要的作用。許多學者研究發現，鎘、鉛、銅作用于水生動物，隨著重金屬質量濃度的增大GSH含量和GST活性明顯降低[21-23]。本研究表明，鎘脅迫下使華溪蟹肝胰腺組織中GSH含量和GST活性顯著下降，說明有大量毒物侵害時，華溪蟹肝胰腺組織本身的解毒作用已經不能達到明顯的效果。而加入LMWC后，GSH含量和GST活性顯著升高，在80mg/L LMWC與鎘聯合作用時有顯著統計學意義。LMWC具有非常好的抗氧化活性，短鏈殼聚糖分子中的活性官能團更容易暴露出來，不僅有利于清除氧自由基，發揮其抗氧化能力[24]，還能通過提高GSH和GST水平，增強機體的解毒能力，減少鎘引起的氧化脅迫效應，對華溪蟹肝胰腺組織有積極的保護作用。

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