折倫諾對人乳腺癌細胞增殖作用及其類雌激素活性評價

鐘賽意，劉壽春，秦小明，王維民，林華娟，諶素華

(1.廣東海洋大學食品科技學院，廣東 湛江 524005；2.北京市農林科學院 北京農業信息技術研究中心，北京 100097)

乳腺癌是嚴重威脅人們生命健康的惡性腫瘤之一，是女性最常見的惡性腫瘤，位居女性惡性腫瘤發病率和死亡率的首位[1]。雌激素對乳腺癌的發生發展都起著非常重要的作用。前人研究已表明，過量的雌激素暴露是乳腺癌發生的因素之一[1-2]。雌激素通過與雌激素受體的結合，以及改變相關的癌基因和抑癌基因的表達，從而誘導乳腺上皮細胞的過度增殖[3]。婦女暴露雌激素的時間越長，發生乳腺癌的風險越大，其中的雌激素除了內源雌激素，還包括外源雌激素，例如食品或環境中存在的具有雌激素樣的化合物，它們能夠模擬或干擾機體內天然雌激素的合成、分泌、轉運、結合、排泄、生理作用等，從而影響生殖系統發育，破壞內分泌系統平衡，甚至導致腫瘤[4]。折倫諾(Zeranol)是一種人工合成的非固醇類二羥基苯甲酸甲酯化合物，屬同化性激素[5-6]，作為肉牛生長促進劑廣泛應用于美國肉牛產業，使用后牛肉中可能會殘存痕量的Zeranol，消費者如果長期過多食用這些牛肉而增加暴露于具有激素樣的環境中，可能會引起潛在危害。美國食品藥品監督管理局(FDA)規定在生的肉牛可食性組織中的最大劑量為：肌肉150μg/kg、肝臟300μg/kg、腎臟450μg/kg和脂肪600μg/kg[7]。然而，越來越多的研究提示，低劑量仍可能存在潛在的致癌作用，目前國際上對其作為肉牛生長促進劑的安全性仍存在較大的爭議，還有待進一步探討[8-9]，已有研究表明[10-12]低濃度Zeranol能促進正常人乳腺細胞、乳腺癌細胞及前脂肪細胞的分裂生長；本實驗的前期研究采用12mg Zeranol片劑體內植入ACI大鼠，也發現110d后在部分大鼠的乳腺部位出現了腫瘤，并發現大鼠含藥血清在體外能誘導原代培養人乳腺癌細胞的增殖[13-14]，但Zeranol對不同雌激素受體乳腺細胞增殖的影響，以及其誘導乳腺癌細胞增殖是否通過雌激素效應發揮作用仍有待研究。本研究采用體外培養的雌激素受體陽性及陰性人乳腺癌細胞系，探討低劑量Zeranol對不同乳腺癌癌細胞的增殖影響及其類雌激素活性，為進一步評價肉中殘留Zeranol的膳食暴露風險評估提供一定的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

雌激素受體陽性(ER+)人乳腺癌細胞MCF-7和雌激素受體陰性(ER－)人乳腺癌細胞MDA-MB-231，購自美國模式培養物集存庫(ATCC)，液氮保存。

Zeranol、雌二醇(E 2)、雌激素受體拮抗劑ICI182,780、霍亂菌素、二甲基亞楓、臺盼藍 美國Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)、胰島素 美國Invitrogen公司；Chelex-100螯合樹脂 美國Bio-Rad 公司；DMEM/F12粉劑、胎牛血清、抗生素-抗真菌溶液、Typsin、EDTA 美國Gibco公司；MTS、PMS 美國Promega公司；葡聚糖被覆活性炭(DCC) 美國Pharmacia公司。

1.2 儀器與設備

T25及T75細胞培養瓶、無菌15mL Falcon試管 瑞士TPP公司；二氧化碳培養箱、醫用凈化工作臺、電熱恒溫干燥箱、低溫冰箱(－80℃) 美國Thermo Forma 公司；微量移液槍(1000、200、50、20μL) 法國Gilson公司；全波長酶標儀 美國Molecular Devices公司；DU-70分光光度計 美國Beckman公司；Milli-Q超純水裝置 美國Millipore 公司；pH計、微量電子天平(萬分之一) 瑞士Mettler-Toledo 公司；微量加樣器 德國Eppendorf 公司；高速低溫離心機 德國Hettich公司；倒置相差顯微鏡 日本Nikon公司；細胞培養板(96孔、24孔)、磁力攪拌器 美國Corning公司；細胞計數板 美國Hausser公司。

1.3 Zeranol溶液的配制

將Zeranol溶于DMSO中，配制l0mg/mL的Zeranol儲備液。溶解后于無菌室中用小型濾器0.22μm膜過濾，并放置在4℃冰箱中備用，實驗時再按照所需濃度用培養液進行相應的稀釋。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養

將MCF-7和MDA-MB-231細胞復蘇后采用75cm2培養瓶開放式單層貼壁培養，培養液為無酚紅高鈣DMEM-F12(體積比1：1)(1.05mmol/L CaCl2)，內含10%胎牛血清FBS和體積分數1%雙抗(青霉素100U/mL和鏈霉素100U/mL)，培養條件為37℃、5%CO2。加受試物前先用PBS洗滌細胞，然后換為無酚紅高鈣DMEM-F12(含5% CDT-FBS)，繼續培養2d，以耗盡細胞內儲存的雌激素。

1.4.2 MTS法檢測細胞增殖

當培養細胞生長至80%～90%融合時，用0.25%胰酶＋0.02% EDTA消化細胞，制成細胞懸液，以每孔100μL 接種于96孔培養板，細胞數為每孔5000個，置于培養箱內(5% CO2，95%空氣，37℃)，貼壁后，吸去培養液，換成相應的新鮮的無血清基礎培養液，再孵育24h，然后加入含Zeranol濃度為2～50nmol/L的培養液。用新鮮培養液稀釋Zeranol儲液，調成相應的濃度。同一濃度組均設4個復孔，溶劑對照組為含0.1% DMSO的培養液。置于培養箱內培養24h后，每孔加總體積為20μL的MTS和PMS混合液，混勻后繼續培養1～3h，待顏色變化穩定后，在酶標儀上讀取波長490nm的吸光度。

1.4.3 Zeranol對MCF-7細胞生長曲線的影響

細胞培養同MCF-7細胞增殖實驗，將總數為5×105個處于細胞對數生長期的MCF-7細胞接種于T25培養瓶中。0.1nmol/L E2為陽性對照，Zeranol劑量為2nmol/L，溶劑對照為1‰ DMSO。每2天換1次培養液，培養4d，采用血球計數板計數，每8h記1次，并繪出各組MCF-7細胞生長曲線。

1.4.4 雌激素受體完全拮抗實驗

取經無酚紅DMEM-F12(含5% CDT-FBS)培養4d后的MCF-7細胞，以每孔2×103個接種于96孔板。培養24h待細胞貼壁后，換為含陽性藥物(E2，0.1nmol/L)及不同濃度Zeranol (2、10、30、50nmol/L) 的無酚紅DMEM/F12培養液，各孔同時分別加入終濃度為1μmol/mL的雌激素受體完全拮抗劑ICI182,780，每種受試物設4個復孔。于24h加入MTS和PMS混合液，孵育1～3h，待顏色變化穩定后，在波長490nm處測定各孔光吸光度，計算平均吸光度和乳腺癌細胞的增殖率，同1.4.2節。

1.5 統計方法

使用Minitab 15 (Minitab Inc. PA)統計軟件，各組間數據比較采用單因素方差分析，P＜0.05認為差異顯著，P＜0.01認為差異極顯著，有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 人乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231的形態觀察

在倒置顯微鏡下觀察乳腺癌細胞MCF-7和MDAMB-231的生長情況，兩株細胞均呈貼壁依賴性生長，細胞接種于培養瓶之后，12h即可基本完全貼壁，MCF-7分化較好，細胞體積增大，胞漿伸出突起，細胞形態為多角形，細胞之間黏附性高，成膜狀生長(圖1A)，傳代時胰酶不易消化；MDA-MB-231分化較差，生長倍增速度快，細胞形態為圓形或長梭形(圖1B)，體積較小，細胞之間黏附性差，傳代時胰酶易消化。

圖 1 人乳腺癌細胞系MCF-7(A)和MDA-MB-231(B)的形態觀察(×100)Fig.1 Morphology of human breast cancer cell lines MCF-7 (A) and MDA-MB-231 (B) (×100)

2.2 Zeranol對MCF-7及MDA-MB-231細胞增殖的影響

圖 2 Zeranol處理對雌激素受體陽性人乳腺癌細胞MCF-7增殖的影響Fig.2 Effect of Zeranol on the proliferation of ER positive human breast cancer cell line MCF-7

圖 3 Zeranol處理對雌激素受體陰性人乳腺癌細胞MDA-MB-231增殖的影響Fig.3 Effect of Zeranol on the proliferation of ER negative human breast cancer cell line MDA-MB-231

雌激素依賴性人類乳腺癌細胞系MCF-7細胞增殖實驗(MCF-7 cell proliferation assay in vitro)又稱為E-Screen測定法。是一種比較經典的體外評價化合物雌激素樣活性的實驗方法。其原理在于雌激素活性物質可以與雌激素受體(ER)結合并刺激ER陽性細胞增殖，此方法已經廣泛應用于快速篩選和評價類雌激素和植物雌激素[15-17]。本實驗采用人乳腺癌雌激素受體陽性細胞系MCF-7和雌激素受體陰性細胞系MDA-MB231進行細胞增殖實驗研究，MTS/PMS比色法測定結果表明(圖2)，與溶劑對照組相比較，2～50nmol/L Zeranol處理24h和48h都能顯著促進MCF-7細胞的增殖(P＜0.05)，其中30～50nmol/L Zeranol處理48h達到極顯著水平(P＜0.01)。雌激素受體陰性MDA-MB-231細胞經不同濃度的Zeranol處理后，與溶劑對照組相比，其增殖率并沒有發生顯著變化(圖3)。與雌二醇(E2)類似，Zeranol在一定劑量范圍內能促進雌激素受體陽性細胞系MCF-7增殖，且呈現出一定的劑量-效應關系，但對雌激素受體陰性細胞系MDA-MB-231無增殖作用，表明Zeranol具有雌激素樣活性。

2.3 Zeranol對MCF-7細胞生長曲線的影響

圖 4 Zeranol處理對MCF-7細胞生長曲線的影響Fig.4 Effect of Zeranol on the growth curve of MCF-7 cells

2nmol/L Zeranol刺激MCF-7細胞增殖的生長曲線與0.1nmol/L E2相似，從24h開始曲線明顯上移。培養24～72h細胞處于對數生長期(圖4)。細胞培養32～72h，2nmol/L Zeranol處理組的細胞數目與0.1nmol/L E2處理組差異不顯著，但均顯著高于溶劑對照組，其中48h后均達到了差異極顯著的水平(P＜0.01)。

2.4 雌激素受體完全拮抗劑ICI182,780對MCF-7細胞增殖的影響

為進一步驗證MCF-7細胞的增殖是否通過雌激素受體發生作用，雌二醇組和各濃度藥物組同時加入終濃度為1μmol/L ICI182,780。ICI182,780為實驗用雌激素受體完全拮抗劑，能完全阻斷E2等雌激素樣物質由雌激素受體介導的一系列生物效應，包括促增殖作用[18]。0.1nmol/L E2及2、10、30、50nmol/L Zeranol誘導的MCF-7細胞增殖作用被1μmol/L ICI182,780完全拮抗，與溶劑對照組的細胞增殖情況差異無顯著性(圖5)。

圖 5 雌激素受體拮抗劑ICI182,780與Zeranol結合處理對MCF-7增殖的影響Fig.5 Effect of Zeranol combined with 1 μmol/L ICI182,780 on the proliferation of MCF-7 cells

3 討 論

乳腺癌是乳腺上皮細胞在各種內外致癌因子的作用下，發生基因突變，細胞失去正常特性而異常增生，以致超過自我修復的限度而發生癌變的疾病[19-20]。乳腺癌分為雌激素依賴(雌激素受體陽性)和非依賴(雌激素受體陰性)兩種類型[21]。研究已表明，雌激素過度暴露是乳腺癌發生的風險之一。一些類雌激素能夠模擬或干擾機體內天然雌激素的合成、分泌、轉運、結合等生理作用。類雌激素化合物對生物體的作用已逐漸引起人們的關注，越來越多的研究[22-23]顯示，食品或環境中存在的類雌激素在動物生殖和發育、神經、免疫和致癌等方面存在潛在的危害效應。

Wilson等[24]用初生幼鹿作為實驗對象，經口給藥，發現Zeranol處理組的幼鹿性發育出現異常，陰囊周長變小，睪丸體積變小，首次射精延遲，精液濃度降低。Coe等[25]研究發現，Zeranol給藥后，能夠引起亞美尼亞倉鼠的急性肝損害，最后導致肝癌的發生，這些癥狀可以通過服用他莫昔芬(一種雌激素受體調節藥物，是雌二醇競爭性拮抗劑，能與乳腺細胞的雌激素受體結合)而得到消除或緩解。但Zeranol對激素敏感性不同的人體細胞的影響仍有待研究。本研究通過Zeranol對人乳腺癌細胞增殖作用及類雌激素活性的研究來探討其在低劑量條件下對人體存在的潛在危害。

目前評價某一化學物質是否具有雌激素活性，還不能從分子結構上加以推測。主要通過測定該化學物質誘導雌激素生理效應的能力來進行。本實驗采用的MCF-7細胞來源于人乳腺癌細胞，是一種雌激素受體表達陽性、對雌激素敏感細胞，廣泛應用于評價雌激素活性以及雌激素對乳腺癌發生及發展機制的研究；MDA-MB-231細胞也是目前乳腺癌研究中最常用的細胞株之一，與MCF-7不同在于，這類細胞株表達波形蛋白(vimentin)，不表達雌激素受體(ER)[26]。本研究采用MTS法檢測細胞增殖，結果表明，Zeranol能顯著增加雌激素依賴性乳腺癌細胞系MCF-7的增殖，而對雌激素非依賴性乳腺癌細胞系MDA-MB-231無顯著影響。生長曲線分析也顯示Zeranol生長曲線明顯上移，與陽性對照雌激素E2具有類似效應。根據雌激素作用原理，雌激素要產生生物學效應，必須先與雌激素受體結合，進而調節相應的基因轉錄，從而產生相應的生物學效應。ICI182,780是一種拮抗雌激素效應的常用藥物，它能完全阻斷E2等雌激素樣物質由雌激素受體介導的一系列生物效應，包括促增殖作用。本實驗結果顯示，ICI182,780能拮抗Zeranol、E2的刺激MCF-7細胞生長的類雌激素活性，說明Zeranol刺激MCF-7細胞生長的類雌激素活性與E2 的作用機制類似，是經與雌激素受體結合而產生的生物學效應。這些結果提示，Zeranol在低濃度條件下仍具有雌激素樣活性，而且其誘導乳腺癌細胞增殖的作用，可能是通過雌激素受體ER信號通路所介導的。本研究可為Zeranol的膳食暴露風險評估提供參考。

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