刺五加苷食用安全性毒理學評價

楊 平，李潤國，孟憲軍*

(1.沈陽師范大學糧食學院，遼寧 沈陽 110034；2.沈陽農業大學食品學院，遼寧 沈陽 110161)

刺五加苷是從刺五加中提取的天然活性成分之一，是由糖或糖衍生物的半縮醛羥基與另一非糖物質中的羥基以縮醛鍵(苷鍵)脫水縮合而成的環狀縮醛衍生物，從刺五加葉中分離出以齊墩果酸為配基或在齊墩果烷型配基上連有單糖鏈或雙糖鏈的13種三萜皂苷[1]，多以刺五加苷B和E作為其提取物標準[2]。有研究報道，刺五加苷具有提高血漿地高辛水平[3]，對抗睡眠剝奪能引起動物學習記憶能力的降低[4]、延緩衰老[5]、減肥[6]等多種生物學作用，對人體肝、腎功能無負面影響[7]，在全球范圍內廣泛應用。目前未見有刺五加苷的系統毒性研究報道，為促進刺五加苷資源的合理開發利用，本研究對刺五加苷進行了急性毒性實驗、遺傳毒性實驗、30d喂養實驗的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

刺五加苷(HPLC測定刺五加苷B+E≥0.8%)購于湖南九匯現代中藥有限公司，為棕色粉末，灌胃時用蒸餾水配制各劑量的濃度，充分混勻后作為受試樣品。

注射用環磷酰胺、順鉑 通化茂祥制藥有限公司；小牛血清 上海銳聰科技發展有限公司；無水乙醇(分析純)、冰醋酸(分析純) 重慶川東化工有限公司；二甲基亞砜(DMSO)、伊紅、Giemsa 北京西美杰科技有限公司；阿的平、2-氨基芴、NaN3、甲基甲烷磺酸酯(均為分析純) 美國Sigma公司。

1.2 動物與菌株

實驗動物由中國科學院上海實驗動物中心提供，SD大鼠和昆明種小鼠(SCXK(滬)2007-0005)，SD大鼠體質量為200～300g，昆明種小鼠體質量為18～22g，實驗前均在實驗室預飼養1周，自由進食普通標準飼料和蒸餾水，實驗室溫度(24±2)℃，相對濕度(50±20)%，自然光照。菌株TA97、TA98、TA100、TA102由遼寧省疾病預防控制中心提供，生物學性狀經鑒定合格。

1.3 儀器與設備

CX21FS1生物顯微鏡 日本Olympus公司；Bp-3100s分析天平 薩多利斯公司；CL8000全自動生化儀 日本島津公司；CD3700 血液分析儀 美國Cell-DYN公司；Mikro-22臺式離心機 德國Hettich公司；HM340E切片機、HMP110脫水機、AP280包埋機、HMS70染色機 德國蔡司公司；GNP-9270型隔水式恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司。

1.4 方法

1.4.1 急性毒性實驗[8]

預實驗結果表明昆明種小鼠的接受劑量超過25000mg/kg，因此本實驗選取20只昆明種小鼠，雌雄各10只，同性別小鼠之間體質量之差不超過3g，按30000mg/kg劑量一次性灌胃，給藥后雌雄小鼠分籠正常飼養，每天觀察小鼠的一般狀態、中毒癥狀和死亡情況等，觀察期為2周。

1.4.2 骨髓細胞微核實驗[9]

將昆明種小鼠隨機分為5組，分別為刺五加苷3個劑量組(10000、5000、2500mg/kg)、蒸餾水陰性對照組、環磷酰胺(40mg/kg)陽性對照組，每組10只，雌雄各半。采用30h兩次灌胃法，按0.4mL/20g灌胃(以體質量計)。實驗結束時，頸椎脫臼處死該組小鼠，取其胸骨骨髓用小牛血清稀釋后進行涂片、固定、Giemsa染色，每只小鼠計數5000個嗜多染紅細胞。

1.4.3 精子畸形實驗[10]

將昆明種小鼠隨機分為5組，每組5只，分別作為樣品高、中、低3個劑量組(10000、5000、2500mg/(kg·d))及蒸餾水陰性對照組和環磷酰胺(40mg/kg)陽性對照組。實驗中各組小鼠每日1次，連續5d灌胃，于首次給樣35d后，頸椎脫臼處死動物，取二側副睪放入生理鹽水中，剪碎，4層過濾，取濾液涂片，固定，2%伊紅染色制片。每鼠鏡檢觀察5000個精子的畸形數，計算精子畸形率。

1.4.4 Ames實驗[11]

Ames實驗設5000、2500、1250、625、312.5μg/皿5個刺五加苷劑量組。另設自然回變對照組、陽性對照組，用Ames實驗標準菌株TA97、TA98、TA100和TA102。在有和沒有肝S9混合液的條件下，分別對上述5個刺五加苷劑量做平板摻入法Ames實驗。各菌株每劑量做3個平行皿，每皿加菌樣0.1mL。培養48h，記錄各皿中回變菌落數量，陽性對照用DMSO作溶劑。

1.4.5 30d喂養實驗[12]

將SD大鼠隨機分為陰性對照組和3個劑量組，每組10只，雌雄各半，3個劑量組分別為1.5、3、6g/(kg·d)刺五加苷灌胃。按樣品人體推薦劑量為12g/(60kg·d)，相當于人體推薦劑量的25、50、100倍。灌胃容量為20mL/kg，每天受試物一次灌胃，對照組灌胃等量蒸餾水，連續30d。大鼠自由進食、水，每天觀察并記錄動物的一般表現，每周稱量一次動物體質量，連續喂養30d。禁食12h后，逐只稱大鼠體質量，乙醚麻醉后，腹主動脈取血進行血清學、生化學檢查，大體解剖肉眼觀察有無明顯病變，取腦、胸腺、心、肝、脾、腎等臟器進行稱質量，計算臟體比，進行組織病理學檢查。

1.5 數據處理

對骨髓細胞微核實驗和精子畸形實驗數據進行卡方檢驗，對大鼠30d喂養實驗數據進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 急性毒性實驗結果

表1 刺五加苷經口急性毒性實驗結果Table 1 Acute toxicity test of eleutheroside in mice

由表1可見，大、小鼠經空腹灌胃后，觀察14d，實驗期間各組小鼠活動正常，毛色正常，未見任何中毒癥狀和死亡。到期處死動物，解剖后肉眼觀察各臟器情況，未見異常。雌、雄小鼠急性經口MTD均大于30g/kg，其劑量相當于人體推薦的750倍。結果表明，刺五加苷屬實際無毒級。

2.2 骨髓嗜多染紅細胞微核實驗結果

表2 刺五加苷對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核發生率的影響(±s，n＝5)Table 2 Effect of eleutheroside on marrow micronucleus rate in mice(±s，n＝5)

表2 刺五加苷對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核發生率的影響(±s，n＝5)Table 2 Effect of eleutheroside on marrow micronucleus rate in mice(±s，n＝5)

注：*.與陰性對照組相比，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與陰性對照組相比，有極顯著性差異(P ＜0.01)。

細胞數 微核率/‰ 微核率P值 嗜多染紅細胞/正染紅細胞(PCE/NCE)陰性對照組 雌性500061.33±0.520.92±0.04雄性500051.01±0.041.04±0.08陽性對照組 雌性5000145** 29.07±1.42*＜0.010.94±0.09雄性5000143** 28.71±1.74*＜0.011.07±0.12刺五加苷低劑量組組別 性別 受檢細胞數微核雌性500061.33±0.52＞0.051.01±0.09雄性500040.80±0.19＞0.050.95±0.04刺五加苷中劑量組雌性500051.40±0.55＞0.050.91±0.05雄性500061.33±0.52＞0.050.93±0.05刺五加苷高劑量組雌性500051.40±0.55＞0.051.06±0.07雄性500040.80±0.28＞0.050.89±0.06

由表2可知，微核實驗中各刺五加苷實驗劑量條件下，嗜多染紅細胞(PCE)微核率、PCE/NCE與陰性對照組的差異均無顯著性，而陽性對照組顯示強烈的致突變作用。因此，刺五加苷在各實驗劑量條件下對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核發生率都沒有顯著影響，顯微鏡觀察見圖1。

圖 1 刺五加苷對小鼠骨髓嗜多染紅細胞微核影響的顯微鏡觀察(×1000)Fig.1 Effect of eleutheroside on mouse marrow micronucleus (×1000)

2.3 精子畸形實驗結果

表3 刺五加苷對小鼠精子畸形發生率的影響(±s，n＝5)Table 3 Effect of eleutheroside on sperm abnormality rate in mice (±s，n＝5)

表3 刺五加苷對小鼠精子畸形發生率的影響(±s，n＝5)Table 3 Effect of eleutheroside on sperm abnormality rate in mice (±s，n＝5)

注：**.與陰性對照組相比，有極顯著性差異(P＜0.01)；﹟﹟.與陽性對照組相比，有極顯著性差異(P＜0.01)。

畸形率/‰P無鉤 香蕉形 胖頭 無定形尾折疊雙頭 雙尾陰性對照組50002105400057 11.4±1.7﹟﹟陽性對照組5000735181562424246 49.2±4.6**＜0.01刺五加苷低劑量組 50000114901052 10.4±1.4﹟﹟ ＞0.05刺五加苷中劑量組 50000015200053 10.6±1.9﹟﹟ ＞0.05刺五加苷高劑量組 50000005800058 11.6±2.3﹟﹟ ＞0.05組別 受檢精子數畸形類型數 畸變精子數

由表3 可知，陰性對照組小鼠的精子畸形率為11.4‰，陽性對照組的精子畸形率為49.2‰，兩組精子畸形發生率差異具有顯著性；而3個劑量刺五加苷組精子畸形率分別為10.4‰、10.6‰、11.6‰，與陰性對照組比都沒有顯著性差異，但顯著低于陽性對照組。因此，刺五加苷在本實驗劑量條件下不會誘發精子畸變，顯微鏡觀察結果見圖2。

圖 2 刺五加苷對小鼠精子畸形的影響 (×400)Fig.2 Effect of eleutheroside on sperm abnormality (×400)

2.4 Ames實驗結果

表4 刺五加苷Ames結果(±s)Table 4 Ames test of eleutheroside(±s)

表4 刺五加苷Ames結果(±s)Table 4 Ames test of eleutheroside(±s)

注：**.與溶劑對照組相比，有顯著性差異(P＜0.01)。

S9(－)S9(+)S9(－)S9(+)S9(－)S9(+)S9(－)S9(+)溶劑對照組176±9178±1249±546±4179±11194±40249±11235±15自然回變組179±6173±1146±648±6175±8197±6268±10258±6 5000μg185±7180±1445±349±5193±14182±9262±12267±6 2500μg183±9183±948±846±3185±8180±6282±9284±12 1250μg168±15167±644±145±6186±12179±11293±36294±34 625μg175±12177±2242±546±3179±10182±10301±53276±32 312.5μg168±10154±1246±345±6181±13186±12307±30278±15組別陽性對照組2593±294** 1646±164** 1815±237** 3464±351** 2345±97** 2597±267** 2137±84** 2459±258**(阿的平(10μg/皿))(2-氨基芴(10μg/皿))(NaN3(1μg/皿))(2-氨基芴(10μg/皿))(甲基甲烷磺酸酯(1μL/皿))(2-氨基芴(10μg/皿))(甲基甲烷磺酸酯(1μL/皿))(順鉑(25μg/皿))

由表4可知，自然回變組、溶劑對照組菌落數均在正常范圍，每劑量實驗組的菌株回變菌落數均未超過自然回變菌落數的2倍，亦無劑量-反應關系；陽性對照組超過自然回變菌落數的2倍以上；在有無S9條件下，各劑量刺五加苷組對4個菌株誘發的回變菌落數均未超過對照組2倍。Ames實驗為陰性結果，刺五加苷對鼠傷寒沙門氏菌無直接和間接致突變作用。

2.5 30d喂養實驗結果

2.5.1 刺五加苷對大鼠體質量的影響

表5 刺五加苷對大鼠體質量的影響(±s，n＝5)Table 5 Effect of eleutheroside on body mass of rats (±s，n＝5) g

表5 刺五加苷對大鼠體質量的影響(±s，n＝5)Table 5 Effect of eleutheroside on body mass of rats (±s，n＝5) g

組別 性別 初始質量 第7天 第14天 第21天 第28天 第30天陰性對照組 雌性201.5±9.12 216.8±8.2 235.5±7.6 252.5±4.8 277.3±5.4 283.5±8.4雄性209.5±7.79 224.8±20.9 242.8±15.6 270.5±12.7 296.6±18.5 310.4±12.4刺五加苷低劑量組雌性206.5±12.2 223.3±16.1 242.1±20.3 262.9±20.7 285.5±18.3 289.3±20.3雄性216.5±12..2 243.3±22.4 262.1±23.5 262.9±19.4 285.5±17.6 290.3±20.3刺五加苷中劑量組雌性206.5±14.1 223.3±24.0 242.1±22.5 262.9±20.5 285.5±16.7 296.3±21.2雄性209.2±19.1 226.2±27.4 248.1±22.2 265.0±14.8 289.0±21.4 301.0±21.7刺五加苷高劑量組雌性208.6±22.3 217.1±22.3 237.7±24.5 255.0±21.6 279.4±20.9 289.3±20.3雄性210.2±21.7 236.2±22.4 258.1±22.3 275.0±20.6 299.0±22.4 305.0±23.0

由表5可知，不同劑量刺五加苷組喂食大鼠30d后，大鼠毛發正常，無異常行為，無死亡。各劑量刺五加苷組大鼠體質量和體質量的變化率與陰性對照組比較都無顯著差異。

2.5.2 刺五加苷對大鼠臟器系數的影響

表6 刺五加苷對大鼠臟器質量的影響(±s，n＝5)Table 6 Effect of eleutheroside on organ index of rats (±s，n＝5) g/100g

表6 刺五加苷對大鼠臟器質量的影響(±s，n＝5)Table 6 Effect of eleutheroside on organ index of rats (±s，n＝5) g/100g

組別 性別 腦 胸腺 心 肝 脾 腎陰性對照組雌性0.48±0.03 0.07±0.01 0.27±0.04 2.67±0.19 0.17±0.02 0.58±0.06雄性0.49±0.04 0.08±0.02 0.26±0.01 2.78±0.18 0.23±0.03 0.57±0.03刺五加苷低劑量組雌性0.57±0.08 0.11±0.03 0.35±0.041 2.89±0.19 0.26±0.01 0.57±0.07雄性0.67±0.05 0.10±0.01 0.32±0.02 2.57±0.20 0.27±0.02 0.76±0.04刺五加苷中劑量組雌性0.73±0.04 0.11±0.01 0.28±0.02 2.72±0.17 0.27±0.01 0.65±0.04雄性0.52±0.09 0.09±0.01 0.32±0.03 2.44±0.09 0.28±0.02 0.71±0.09刺五加苷高劑量組雌性0.47±0.02 0.07±0.01 0.29±0.02 2.73±0.19 0.21±0.02 0.66±0.02雄性0.49±0.04 0.06±0.02 0.25±0.01 2.79±0.14 0.22±0.01 0.62±0.05

由表6可知，刺五加苷喂食大鼠30d后，各劑量組雌、雄大鼠肝、腎、脾、睪丸和卵巢器官質量/體質量系數與陰性對照組比較均無顯著差異。對大鼠的肝、腎、脾、睪丸和卵巢進行解剖發現，上述器官外觀顏色、大小均正常，未見明顯萎縮、水腫、滲出、增生等病變，未見有明顯中毒性病理改變。

2.5.3 對大鼠血常規指標的影響

表7 刺五加苷對大鼠血常規指標的影響(±s)Table 7 Effect of eleutheroside on blood cells in rats (±s)

表7 刺五加苷對大鼠血常規指標的影響(±s)Table 7 Effect of eleutheroside on blood cells in rats (±s)

血小板數目/(109個/L)陰性對照組5.38±1.24 7.31±0.29 152.00±6.89 43.43±1.29 58.07±1.13 899.63±77.59刺五加苷低劑量組 6.33±0.68 7.04±0.47 148.38±3.66 42.31±2.14 58.43±1.49 913.50±37.89刺五加苷中劑量組 6.17±0.92 6.74±0.84 147.71±3.99 41.87±2.40 58.23±1.45 921.43±56.74刺五加苷高劑量組 5.99±1.05 7.23±0.56 147.89±3.30 41.72±1.61 58.17±1.33 901.22±57.17組別 白細胞數/(109個/L)紅細胞數/(1012個/L)血紅蛋白質量濃度/(g/L)平均紅細胞體積/(10－7L)紅細胞壓積/%

由表7可知，各實驗組血常規指標檢驗結果與陰性對照組相比均無顯著差異。表明刺五加苷對大鼠血液生化指標無明顯影響。

2.5.4 對大鼠血清生化指標的影響

表8 刺五加苷對大鼠血清生化指標的影響(±s)Table 8 Effect of eleutheroside on biochemical properties of rat serum (±s) nmol/L

表8 刺五加苷對大鼠血清生化指標的影響(±s)Table 8 Effect of eleutheroside on biochemical properties of rat serum (±s) nmol/L

組別 谷丙轉氨酶 谷草轉氨酶 總蛋白 白蛋白 球蛋白 血肌酐 血尿酸陰性對照組35.86±2.67 112.00±11.36 69.30±3.06 37.42±1.94 33.89±3.99 62.00±4.34 169.50±15.78刺五加苷低劑量組 35.50±3.78 113.00±11.31 70.85±6.41 35.96±1.02 32.33±2.81 59.25±5.57 161.13±12.77刺五加苷中劑量組 36.17±3.37 136.50±4.43 68.50±3.18 35.93±1.32 31.50±3.25 53.25±9.27 159.00±27.11刺五加苷高劑量組 37.80±1.64 123.00±6.25 66.82±2.88 41.10±9.56 31.56±1.78 55.30±9.66 157.50±20.63

由表8可知，雌、雄大鼠的對照組空白和各劑量組血液生化指標，谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶、總蛋白、白蛋白、球蛋白、血肌酐、血尿酸與陰性對照組相比無明顯異常改變。結果表明，刺五加苷對大鼠血液生化指標無明顯影響。

3 討 論

刺五加是五加科刺五加屬的落葉灌木，作為第3代果品，化學成分多樣，營養成分豐富。刺五加苷B和E可以被大鼠腸道菌群代謝[13]，在免疫調節、抗疲勞、中樞神經系統及心血管方面的生物活性較為顯著，具有增強血管性癡呆大鼠的學習、記憶能力[14]，增強免疫功能和促誘生干擾素的能力[15]，對癌細胞有一定的抑制作用[16]。隨著對刺五加應用的不斷擴展，較大量攝入刺五加苷的安全性受到研究者的關注。本研究依照《保健食品檢驗與評價技術規范》[17]的規定，刺五加苷的急性毒性結果須滿足動物未現死亡劑量≥10g/kg(即涵蓋人體推薦量的100倍)，才能進行第2階段毒理學研究。本實驗中刺五加苷第1階段急性毒性實驗小鼠雌、雄兩性MTD均大于20g/kg，其劑量相當于人體用量1.67g/kg，人體推薦用量1000倍，屬實際無毒級，因而可以進入第2階段毒理學實驗。刺五加苷第2階段毒理學實驗主要進行了遺傳毒性實驗和30d喂養實驗。遺傳毒性實驗進行小鼠骨髓細胞微核實驗、小鼠精子畸形實驗和Ames實驗，從三方面探討了刺五加苷的遺傳毒性，其3項實驗結果均為陰性，表明刺五加苷在實驗條件下對小鼠無遺傳毒性。30d喂養實驗通過高中低劑量刺五加苷每天灌胃，觀察其對大鼠引起有害效應的劑量、毒作用性質和靶器官，估計亞慢性攝入的危害性，并可初步估計其最大無作用劑量。結果表明，刺五加苷對雌、雄大鼠的體質量、臟體比、血常規、血清生化指標均無明顯影響，腦、胸腺、心、肝、脾、腎均未見明顯病理組織學改變，其最大無作用劑量為6g/kg，相當于人體推薦劑量的100倍。從毒理學角度看，刺五加苷在實驗劑量范圍內無急性毒性，無遺傳毒性，長期食用對人無害，可以作為保健食品進行相關功能研究。

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