豬股骨頭膠原蛋白水解產物的降血壓作用

陳 碩，李 誠*，李 娜，付 剛

(四川農業大學食品學院，四川 雅安 625014)

高血壓病是一種常見的多發病，據推測目前世界1/4的成年人患有高血壓，這一數據預計到2025年會增加到30%[1]。全球約有760萬人由于高血壓病早逝，約占全球病死率13.5%；由高血壓引起的卒中和缺血性心臟病分別達54%和47%[2]。高血壓病已成為一個十分嚴重的社會公共衛生問題。天然食品中的降血壓肽通常是由蛋白質水解酶在溫和條件下水解蛋白質而獲得的一類多肽，具有降壓效果且無副作用。許多動物、植物、微生物蛋白及發酵食品中都含有豐富的降血壓肽，目前已成功地從牛奶、魚、貝、雞蛋、大豆、清酒和酒粕、玉米、麥胚等食物中分離出了各種不同的ACE抑制肽[3-6]。

我國是一個畜牧業大國，在肉類生產中，每年產生近2000萬t的各類畜禽骨，絕大多數的畜禽骨沒有得到充分利用[7]。這不僅浪費了寶貴的蛋白質資源，而且對環境造成嚴重的污染。目前，對骨的開發利用多集中在對骨鈣研究，而骨蛋白質多集中于調味品和營養強化方面的研究開發[8-9]，而功能性方面的深入研究報道較少。利用現代高新技術開發高附加值的降壓產品，進一步提高副產物的利用率，對副產制品的工業化和生態環境保護都具有重要意義。

根據本實驗前期研究，與豬骨其他部位比較，豬股骨頭膠原蛋白水解物具有較好的短期降壓效果。因此本實驗選用豬股骨頭制備膠原多肽，以自發性高血壓大鼠(SHR)血壓為指標，確定降壓效果最佳的豬股骨頭膠原蛋白多肽濃度，并通過連續灌胃實驗驗證其長期降壓效果，為進一步研究利用豬股骨頭膠原蛋白開發降壓產品提供參考和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮豬股骨頭購自雅安農貿市場。

胰蛋白酶(Trypsin 1：250) 美國Amresco公司；卡托普利(Captopril) 汕頭金石制藥廠。

SHR，雌性，10周齡，體質量(165±10)g，購自北京維通利華公司。

1.2 儀器與設備

BP-98A智能無創血壓計 日本Softron公司；BR4i型多功能冷凍離心機、POWERDRY PL 3000凍干機 美國Thermo公司；UV-2102 PCS型紫外-可見分光光度計 美國Unico公司；超濾離心管(膜截留分子質量5000、10000D) 美國Millipore公司；數顯恒溫水浴鍋 中國金壇市富華儀器有限公司；BT-12S電子天平 德國Sartorius公司；數顯恒溫水浴鍋 中國金壇市富華儀器有限公司；PHS-3C酸度計 中國方舟科技公司；海爾臥式冷藏冰柜 中國青島海爾集團。

1.3 方法

1.3.1 豬股骨頭膠原多肽制備

豬股骨頭膠原蛋白多肽參照魏庭浩[10]的方法，將新鮮豬股骨頭進行碎骨、脫脂、浸酸、浸灰和中和淌干后，用0.5%的H2O2在100℃、pH8.0條件下處理7h提取膠原蛋白，再采用胰蛋白酶在溫度50℃、pH7.5、底物質量分數6%、酶底比8000U/g的條件下酶解豬骨膠原蛋白6h。采用超濾分級的方法分離純化酶解液中的降血壓肽，取超濾離心后分子質量小于5000D的肽段冷凍干燥后制得。

1.3.2 單次灌胃實驗

將SHR適應性喂養1周后，隨機分為8組，每組8只：陰性對照組(NC)灌胃蒸餾水；A、B、C、D、E、F組，分別按20、30、40、50、60、70mg/kg劑量灌胃豬股骨頭膠原蛋白水解產物(用蒸餾水溶解)；陽性對照組(PC)灌胃10mg/kg卡托普利懸濁液。灌胃前用尾動脈血壓測量器測定每只SHR尾動脈血壓，然后空腹灌胃相應劑量溶液，灌胃后每2h分別測定各組SHR尾動脈收縮壓。選取降壓效果較好的3個劑量組作為連續灌胃的實驗組。

1.3.3 連續灌胃實驗

將SHR適應性喂養1周后，隨機分成5組，每組8只：陰性對照組(NC)灌胃蒸餾水；實驗組為低劑量組(L)、中劑量組(M)、高劑量組(H)，按照30、50、70mg/(kg·d)劑量灌胃豬骨膠原蛋白水解產物(用蒸餾水溶解)；陽性對照組(PC)灌胃10mg/(kg·d)卡托普利懸濁液。每天同一時間空腹灌胃相應劑量溶液，每5d采用尾動脈血壓測量器分別測定各組SHR尾動脈血壓(灌胃前測量)。連續灌胃30d。

1.4 數據統計

2 結果與分析

2.1 單次灌胃對SHR收縮壓的影響

表1 單次灌胃豬股骨頭膠原蛋白水解產物對 SHR收縮壓的影響(±s)Table 1 Effect of single administration of collagen hydrolysates from swine femur head on the systolic pressure of spontaneous hypertension rats (±s) mmHg

表1 單次灌胃豬股骨頭膠原蛋白水解產物對 SHR收縮壓的影響(±s)Table 1 Effect of single administration of collagen hydrolysates from swine femur head on the systolic pressure of spontaneous hypertension rats (±s) mmHg

注：*.與本組灌胃前相比，有顯著性差異(P＜0.05)；**.與本組灌胃前相比，有極顯著性差異(P＜0.01)。

組別 灌胃前 灌胃后2h4h6h8h10h NC154.5±9.1154.3±14.8151.6±5.7156.6±7.9152.0±9.1153.0±13.3 A154.9±10.3 156.4±7.8 153.8±11.3 156.9±8.2156.3±8.0 150.4±5.5 B158.9±6.5 154.2±5.4 151.4±7.6* 149.9±11.6** 151.7±9.7 148.7±9.6*C156.9±12.2 147.2±11.8** 149.2±10.6** 149.3±11.7* 154.8±10.1 147.1±9.7 D157.4±14.6150.9±9.4 144.8±12.7** 138.2±15.2** 150.2±11.0* 152.3±7.4 E160.7±7.4160.1±8.4 153.1±7.8** 153.2±11.1** 157.3±9.9* 140.7±12.1** F160.4±11.9159.9±6.8 155.3±14.4 145.4±13.5** 142.1±18.5** 140.4±19.2** PC158.8±6.5 148.1±6.6** 141.7±10.0** 146.6±9.2** 142.9±12.1** 136.6±7.7**

由表1可知，與灌胃前收縮壓比較，A組沒有顯著的降壓效果；B組在灌胃后4h收縮壓出現顯著下降，至10h時下降值最大，達到10.2mmHg；C組在灌胃后2h收縮壓出現極顯著下降，下降最大值達到9.7mmHg；D組在灌胃后4h出現極顯著下降，至6h時下降值最大，達到19.2mmHg；E組在灌胃后4h出現極顯著下降，至10h時下降值最大，達到20.0mmHg；F組在灌胃后6h出現極顯著下降，至10h時下降值達到20.0mmHg。可見6個實驗組除A組沒有顯著降壓效果外，其他各組均有不同程度的降壓效果。選擇30、50、70mg/kg劑量，分別作為多次灌胃的低劑量組、中劑量組和高劑量組。

2.2 連續灌胃對SHR血壓的影響

2.2.1 連續灌胃對SHR收縮壓的影響

由表2可知，與同時段陽性對照組比較，各劑量組收縮壓總體上無顯著差異。與同時段陰性對照組比較，低、中、高劑量組SHR收縮壓均出現極顯著降低，且穩定持續降低。其中，低劑量組在30d時降壓值達到19.8mmHg；中劑量組下降值達24.5mmHg；高劑量組SHR收縮壓下降值達17.1mmHg。中、低劑量組顯現出更好的降壓效果。

表2 連續灌胃豬股骨頭膠原蛋白水解產物對 SHR收縮壓的影響(±s)Table 2 Effect of swine collagen hydrolysates administrated for 30 days on the systolic pressure of spontaneous hypertension rats (±s)mmHg

表2 連續灌胃豬股骨頭膠原蛋白水解產物對 SHR收縮壓的影響(±s)Table 2 Effect of swine collagen hydrolysates administrated for 30 days on the systolic pressure of spontaneous hypertension rats (±s)mmHg

注：#.與同時期陰性對照組(NC)相比，有顯著性差異(P＜0.05)；##.與同時期NC 相比，有極顯著性差異(P＜0.01)；+.與同時期陽性對照組(PC)相比，有顯著性差異(P＜0.05)；++.與同時期PC 相比，有極顯著性差異(P＜0.01)。下同。

組別 灌胃前 灌胃后5d10d15d20d25d30d NC160.5±7.4163.8±10.7 166.0±7.4++ 164.8±6.3++ 170.1±5.9++ 171.0±6.3++ 168.1±7.4 ++L159.9±10.6 148.2±11.9##++ 149.6±10.9 ## 146.9±9.5 ## 141.1±10.3 ## 151.6±8.9 ## 148.3±11.6 ##M157.1±10.6 147.2±10.8##++ 147.1±12.1 ## 147.6±11.0 ## 141.4±8.8 ## 145.0±10.2 ## 143.6±11.3##H157.5±8.5 152.6±11.9 ##+ 158.6±8.5 157.0±8.3##+ 154.1±4.3 ##+ 158.5±10.9##++ 151.0±8.7##PC162.2±9.5159.2±7.0 154.5±12.1 ## 151.1±9.8## 146.2±10.3 ## 146.6±9.3 ## 143.5±13.8##

2.2.2 連續灌胃對SHR舒張壓的影響

表3 連續灌胃豬股骨頭膠原蛋白水解產物對 SHR舒張壓的影響(±s)Table 3 Effect of swine collagen hydrolysates administrated for 30 days on the diastolic pressure of spontaneous hypertension (±s) mmHg

表3 連續灌胃豬股骨頭膠原蛋白水解產物對 SHR舒張壓的影響(±s)Table 3 Effect of swine collagen hydrolysates administrated for 30 days on the diastolic pressure of spontaneous hypertension (±s) mmHg

組別 灌胃前 灌胃后5d10d15d20d25d30d NC128.6±9.4 132.4±15.8 136.6±9.1+ 140.0±13.5+ 135.2±11.7++ 136.8±11.5+ 140.8±12.1++ L126.3±14.2 124.0±10.6 #++ 128.7±14.3 122.4±12.1##++ 122.0±13.7 ## 127.8±11.8 # 125.1±12.3 ##M125.5±16.2 121.6±13.3##++ 125.2±10.9 ## 123.7±10.4##+ 119.3±9.9 ## 127.0±11.9 # 121.8±14.7 ##H125.5±10.4 125.4±11.2+ 132.3±14.1 130.1±10.5 ## 128.2±11.6 # 130.3±23.4 # 127.6±9.6 ##PC 125.1±14.0 134.4±9.5 129.9±15.1 131.9±12.4 # 125.2±14.0 ## 126.4±8.0 # 121.5±15.0 ##

由表3可知，與同時段陽性對照組比較，除個別時段外，各劑量組舒張壓總體上無顯著差異。與同時段陰性對照組比較，低、中、高劑量組SHR舒張壓總體上均出現極顯著降低。其中低劑量組在30d時降壓值達到15.7mmHg；中劑量組下降值達19.0mmHg；高劑量組下降值達13.2mmHg。中、低劑量組顯現出更好的降壓效果。

3 討論與結論

現已研究出多種中藥提取物或食源性多肽具有較好的降壓效果，如楊浩等[11]研究發現按照1600mg/(kg·d)茶皂苷高劑量連續灌胃SHR，第4周收縮壓平均值下降18.67mmHg；黃開珍等[12]研究發現只有按照2g/(kg·d)白子菜水提物的高劑量連續灌胃SHR，才有顯著的降壓效果，第5周收縮壓平均值下降18.0mmHg，舒張壓下降7.4mmHg；王進等[13]考察了玉米大豆復合肽對SHR的降血壓作用，50mg/kg劑量玉米大豆復合肽一次性給藥后降血壓作用可一直持續3h，長期實驗中，SHR血壓顯著降低24.58mmHg；李利生等[14]研究發現按照500mg/(kg·d)杜仲降壓片劑量連續灌胃SHR，第4周收縮壓平均值下降29.0mmHg，舒張壓下降32.5mmHg。本實驗豬股骨頭膠原蛋白水解產物的灌胃量30mg/(kg·d)，連續灌胃30d SHR收縮壓下降19.8mmHg，舒張壓下降15.7mmHg；50mg/(kg·d)連續灌胃30d SHR收縮壓下降24.5mmHg，舒張壓下降19.0mmHg。通過與以上植物型原材料制備的降血壓產品對比，豬股骨頭膠原蛋白水解產物的灌胃量更小，且具有更好的長期降壓效果，選用豬股骨頭膠原蛋白作為原材料制備降血壓產品更好。

Jung等[15]用α-胰凝乳蛋白酶水解黃鰭仙魚骨蛋白，在低于5000D的組分中分離出包含了11個氨基酸ACE抑制肽，能顯著降低SHR血壓；Lee等[16]用胃蛋白酶水解鮪魚骨蛋白質，得到5000D以下的肽段ACE抑制活性最高，并且能夠顯著降低SHR收縮壓；王金玲等[17]以酸性蛋白酶水解帶魚脊骨，超濾制備得到分子質量小于3000D的降血壓肽長期飼喂低劑量組(10mg/(kg·d))使SHR血壓下降15mmHg，高劑量組(50mg/(kg·d))組對SHR降壓幅度達到20mmHg，并且降壓效果穩定。通過對比，豬股骨頭膠原蛋白水解物的降壓效果略優于魚骨蛋白水解產物；同時豬骨產量大、易得，因此利用豬骨開發降血壓產品具有及其廣闊的開發前景。

豬股骨頭膠原蛋白水解產物能長期穩定地降低SHR血壓；在30～70mg/(kg·d)劑量范圍內，中、低劑量具有更好的降壓效果。

[1] FERNANDEZ-MUSOLES R, LOPEZ-DIEZ J J, TORREGROSA G, et al. Lactoferricin B-derived peptides with inhibitory effects on ECEdependent vasoconstriction[J]. Peptides, 2010, 31(10)： 1926-1933.

[2] 陳玲, 鄒栩. 全球心血管藥物研發動態[J]. 中國新藥雜志, 2010, 19(1)： 8-16.

[3] FUJITA H, YOSHIKAWA M, LKPN M. a prodrug-type ACEinhibitory peptide derived from fish protein[J]. Immunopharmacology, 1999, 44(1/2)： 123-127.

[4] 肖平, 周麗珍, 李艷, 等. 降血壓肽制備工藝的研究進展[J]. 食品工業科技, 2010, 31(8)： 417-420.

[5] TOVAR-PERE E, GUERRERO-LEGARRETA I, FARRESGONZALEZ A, et al. Angiotensin Ⅰ-converting enzyme-inhibitory peptide fractions from albumin 1 and globulin as obtained of amaranth grain[J]. Food Chemistry, 2009, 116(2)： 437-444.

[6] MIGULE M, ALVAREZ Y, LOPEZ-FANDINO R, et al. Vasodilator effects of peptides derived from egg white proteins[J]. Regulatory Peptides, 2007, 140(3)： 131-135.

[7] 王衛, 張志宇, 劉達玉, 等. 畜禽骨加工利用及其產品開發[J]. 食品科技, 2009(5)： 154-158.

[8] 岑寧, 葛正廣. 豬產品加工新技術[M]. 北京： 中國農業出版社, 2002.

[9] 羅通彪. 畜禽鮮骨的開發利用[J]. 食品研究與開發, 2003, 24(5)： 70-73.

[10] 魏庭浩. 豬骨膠原多肽的制備及其血管緊張素轉換酶抑制活性的研究[D]. 雅安： 四川農業大學, 2010.

[11] 楊浩, 邵翔, 俞國華. 茶皂甙對自發性高血壓大鼠血壓的影響研究[J]. 中國臨床保健雜志, 2007, 10(3)： 270-272.

[12] 黃開珍, 郝永靖, 曾春暉, 等. 白子菜水提物對自發性高血壓大鼠降血壓作用的實驗研究[J]. 中成藥, 2009, 31(10)： 1505-1508.

[13] 王進, 何慧, 郭輝. 玉米大豆復合肽體內ACE 抑制活性研究[J]. 中國糧油學報, 2009, 24(8)： 38-41.

[14] 李利生, 余麗梅, 黃燮南, 等. 杜仲降壓片對自發性高血壓大鼠血壓的影響及機制研究[J]. 中成藥, 2011, 33(7)： 1236-1238.

[15] JUNG W K, MENDIS E, JE J Y. Angiotensin Ⅰ-converting enzyme inhibitory peptide from yellowfin sole (Limanda aspera) frame protein and its antihypertensive effect in spontaneously hypertensive rats[J]. Food Chemistry, 2006, 94(1)： 26-32.

[16] LEE S H, QIANG Zhongji, KIM S K. A novel angiotensin Ⅰ converting enzyme inhibitory peptide from tuna frame protein hydrolysate and its antihypertensive effect in spontaneously hypertensive rats[J]. Food Chemistry, 2010, 118(1)： 96-102.

[17] 王金玲, 何國慶. 酶解法制備帶魚脊骨降血壓肽及其降血壓效果[J]. 食品與發酵工業, 2010, 36(4)： 54-57.