低聚果糖、乳酸桿菌對便秘模型大鼠的通便功能影響

劉曉梅，彭芝榕，倪學勤,3,*，楊 杰，鄒昭勇，邱春紅，曾 東,3，楊立格

(1.四川農業大學動物醫學院動物微生態研究中心，四川 雅安 625014；2.四川農業大學動物醫學院生物工程系，四川 雅安 625014；3.動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 雅安 625014)

便秘是臨床常見的復雜癥狀，隨著人們飲食結構的改變及精神心理和社會因素的影響，便秘發病率有增高趨勢，困擾著多數職場人士和眾多的老年人，嚴重影響他們的生活質量。便秘人群易出現腸道菌群紊亂，長期便秘還與急性心腦血管疾病、癡呆、結直腸癌等有密切的關系[1-4]。研究表示，近十幾年來，因各類便秘治療藥物在臨床研究和應用中顯現諸多問題，比如療效不確切、特異性不強、不良反應多和治療范圍局限等缺陷，沒得到更多的研究與開發[5]。劉會艷等[6]認為微生態制劑可直接補充正常生理性細菌，調整腸道菌群，促進機體對營養物質的分解與吸收，較適用于老年人便秘的治療。乳酸桿菌作為有益菌，可通過其抑菌活性、免疫增強作用及促進營養物質消化吸收等方面的作用而維持宿主腸道微生態平衡、增強宿主免疫功能并提高動物生產性能，加強腸道的蠕動和消化液的分泌[7-8]，改善老年人習慣性便秘[9-10]。低聚果糖(fructooligosaccharide，FOS)又稱果寡糖，是低聚糖類微生態調節劑中最常用的制品之一，可選擇性增值雙歧桿菌，抑制有害菌的增殖，促進腸道蠕動，尤其適用于老年人[11-13]。鄭麗華等[14]指出，長期服用果導片、番瀉葉、蘆薈膠囊等治療便秘的藥物，會造成電解質紊亂、低血鉀、維生素缺乏、腸道炎癥，嚴重可誘發結腸黑變等癌前病變和精神源性假性梗阻，因此針對便秘的藥物研究，主要集中于胃腸動力劑、滲透性瀉藥以及純天然藥物。低聚果糖和乳酸桿菌均為天然藥物，都具有通便作用，但是最佳使用劑量和相互的比較未見報道。因此本項目擬參照文獻[15]，使用鹽酸洛哌丁胺建立Wistar大鼠便秘模型，探討不同劑量低聚果糖和乳酸桿菌對便秘大鼠通便功能的影響，為臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

植物乳酸桿菌由四川農業大學動物醫學院動物微生態研究中心提供。

番瀉葉、鹽酸咯派丁胺 雅安市怡人堂大藥房；低聚果糖(純度≥90%) 廣東省江門星子高科生物股份有限公司；其余試劑均為分析純。

PYX-DHS隔水式電熱恒溫培養箱 上海市躍進醫療器械一廠；SW-CJ-2FD潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；CO2培養箱、臺式高速冷凍離心機 美國Thermo公司；CMD-20X智能型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海瑯實驗設備有限公司；BCD-213K/T柜式冰箱 Haier公司。

1.2 受試動物

健康S P F 級雄性Wistar 大鼠3 6 只，體質量為(130±3.67)g，購自成都達碩生物有限公司，動物合格證號：scxk(川)2008-24。在四川農業大學獸醫院動物實驗房(室溫(23±1)℃，相對濕度45%～50%，12h光照：12h黑暗)以標準飼料單籠適應飼養7d后開始實驗。

1.3 受試樣品

低聚果糖溶液：高劑量(0.5g/mL)、中劑量(0.25g/mL)、低劑量(0.125g/mL)3個劑量組。

乳酸桿菌菌懸液：將植物乳酸桿菌活化、擴大培養后進行計數，分別配制高(1.0×1010CFU/mL)、中(1.0×109CFU/mL)、低(1.0×108CFU/mL)3個劑量組。

番瀉葉浸劑：稱取藥用番瀉葉5.0g置于100.0mL沸水中浸泡25min，冷卻后以紗布過濾藥液，棄藥渣不用，所得的番瀉葉溶液定量至1000mL，得含生藥5.0×10-3g/mL的番瀉葉浸液，115℃滅菌15min后置4℃冰箱備用。

1.4 方法

1.4.1 大鼠便秘模型造模[15]

取體質量接近的Wistar大鼠36只，隨機選4只作為正常對照組(第1組)，灌胃生理鹽水，其余大鼠連續3d按3.0mg/kg體質量灌喂咯派丁胺(咯派丁胺溶于1.0mL質量分數為0.9%的生理鹽水)造便秘模型。

1.4.2 便秘大鼠分組與處理

取造模成功的32只大鼠，隨機分成8組，每組4只，分別為：第2組(模型對照組)、第3組(番瀉葉浸劑治療對照組)、第4組(乳酸桿菌高劑量組)、第5組(乳酸桿菌中劑量組)、第6組(乳酸桿菌低劑量組)、第7組(低聚果糖高劑量組)、第8組(低聚果糖中劑量組)、第9組(低聚果糖低劑量組)。除第1組和第2組外，其余各組大鼠按2.0mL/kg體質量的劑量連續7d灌胃相應受試樣品，第1、2組同法同量灌胃生理鹽水。

1.4.3 測定指標

在便秘模型造模3d與受試樣品灌喂7d期間，記錄大鼠采食量(mL)、飲水量(mL)、體質量增量(g)、最后24h的糞便粒數、糞便鮮質量和干質量，按式(1)計算糞便含水率。

式中：mf為糞便鮮質量/g；md為糞便干質量/g。

1.4.4 小腸運動實驗

第7天灌胃受試樣品后，所有大鼠禁食不禁水24h，每只大鼠灌喂1.0mL炭末液(3.0g炭末溶于50.0mL 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液)，30min后斷頸處死，剖腹，將消化道幽門至回盲瓣部分完全取出，測量小腸全長及炭末推進長度，按式(2)計算小腸炭末推進率。

1.4.5 腸道菌群檢測[16]

第7天灌胃受試樣品后，收集大鼠新鮮糞便，取0.2～0.5g糞便經PBS 10倍遞增稀釋成10－1～10－6倍系列稀釋液，取適當稀釋度樣品10μL接種在各類培養基上，每個稀釋度做3個重復。按相應要求和條件進行培養，以菌落形態、革蘭氏染色鏡檢、生化反應等鑒定計數菌落，求平均值，計算每克濕便中的菌數。雙歧桿菌和乳酸桿菌分別用TPY瓊脂和MRS瓊脂，37℃厭氧培養48h。腸桿菌用EMB瓊脂，37℃需氧培養48h。腸球菌用EC瓊脂，37℃需氧培養48h。

1.5 數據處理

采用SPSS 20.0軟件包對所得數據進行統計分析，各組以變異數(ANOVA)進行比較，采用Duncanny’s multiple range test方法分析。如遇顯著差異時再進一步以鄧肯氏新多變域驗定分析處理均數間之差異，數據以±s表示，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果與分析

2.1 大鼠便秘模型造模

在整個實驗期間，大鼠均正常生長。由表1可知，模型對照組采食量、飲水量、體質量增量、糞便粒數以及糞便含水率均明顯低于正常對照組(P＜0.05)，實驗期間未出現大鼠腹瀉現象，表明Wistar大鼠便秘模型造模成功。

表1 正常對照組和模型對照組的采食量、飲水量、體質量增量、糞便粒數及糞便含水率比較(±s, n=4)Table 1 Comparison of feed intake, water intake, body mass gain, number of feces grains and feces moisture content beween control group and constipation group (±s, n=4)

表1 正常對照組和模型對照組的采食量、飲水量、體質量增量、糞便粒數及糞便含水率比較(±s, n=4)Table 1 Comparison of feed intake, water intake, body mass gain, number of feces grains and feces moisture content beween control group and constipation group (±s, n=4)

注：同行不同小寫字母代表差異顯著(P＜0.05)。

指標 正常對照組 模型對照組采食量/g70.13±5.9856.98±6.29a飲水量/mL145.50±12.7995.25±27.11a體質量增量/g12.25±5.561.75±4.72a糞便粒數39.50±8.1025.25±4.99a糞便含水率/%52.65±5.3743.63±3.71a

2.2 受試樣品對便秘大鼠采食量、飲水量、體質量增量、排便功能和小腸運動的影響

由表2可知，各受試樣品組與第2組相比，大鼠的采食量均極顯著提高(P＜0.01)，其中第4組的采食量最高并顯著高于第5、6組(P＜0.05)；除第7、8組外，其他受試樣品組便秘大鼠的飲水量均極顯著提高(P＜0.01)；除第8組外，其他組大鼠的小腸炭末推進率均極顯著提高(P＜0.01)；除第5、9組外，其他組大鼠的糞便粒數均顯著增加(P＜0.05)，其中，第6、7組大鼠的糞便粒數均極顯著增加(P＜0.01)；除第4組外，其他組大鼠的糞便含水率均顯著提高(P＜0.05)，其中，第6、7、8組大鼠的糞便含水率均極顯著提高(P＜0.01)。表明給予受試樣品后，均可提高便秘動物采食量，對其無不良健康影響并具有通便功能，且以第6、7組效果最好。各組與第3組相比，除第6組外，其他組的采食量均極顯著提高(P＜0.01)；除第5、8組外，其他各組飲水量均與第3組差異不顯著；第6、9組大鼠的小腸炭末推進率顯著低于第3組(P＜0.05)，第4、5、7組大鼠的小腸炭末推進率極顯著低于第3組(P＜0.01)。表明低聚果糖、乳酸桿菌較番瀉葉可更好的維持便秘動物正常飲食且具有如番瀉葉般的通便功能，但小腸推動作用結果提示番瀉葉的通便效果較佳。與第1組相比，受試樣品除第5、8組外，大鼠的體質量顯著增加(P＜0.05)，其中以第6、7、9組增加量較高，表明受試樣品對大鼠的生長發育無不良影響。

表2 受試樣品對便秘大鼠采食量、飲水量、體質量增量、排便功能和小腸運動的影響(±s，n=4)Table 2 Effect of fructooligosaccharides and Lactobacillus on feed intake, water intake, body mass increase, bowel function and small intestine movement of constipation rats (±s，n=4)

表2 受試樣品對便秘大鼠采食量、飲水量、體質量增量、排便功能和小腸運動的影響(±s，n=4)Table 2 Effect of fructooligosaccharides and Lactobacillus on feed intake, water intake, body mass increase, bowel function and small intestine movement of constipation rats (±s，n=4)

注：同列不同大寫字母代表差異極顯著(P＜0.01)；不同小寫字母代表差異顯著(P＜0.05)。下同。

組別 采食量/g飲水量/mL體質量增量/g 小腸炭末推進率/%糞便粒數 糞便含水率/%第1組 119.76±3.20Ccd 225.10±30.14BCcd 13.00±4.36a75.65±1.35Cc44.75±6.95Bc66.30±8.39Ce第2組 102.30±5.55Aa 184.33±28.60ABab 12.00±5.00a50.92±5.59Aa31.25±1.71Aa58.52±4.36Aa第3組 111.16±2.12Bb 213.70±19.36ABCbc 12.67±2.52a76.12±4.89Cc39.00±6.78ABbc 63.10±1.23BCcde第4組 125.01±3.97Cd 230.85±11.10Ccd 21.00±3.60bc62.30±2.48Ba38.25±4.92ABbc 59.00±3.64ABab第5組 118.61±3.29Cc 249.30±14.81Cd12.33±2.31a65.50±3.65Bb34.50±2.52ABabc 61.35±3.76ABbc第6組 117.93±5.72BCc 227.18±6.14Ccd27.67±4.73d68.12±4.03BCb42.00±2.94Bbc 67.95±2.60BCcde第7組 120.88±2.23Ccd 223.00±25.39BCcd 22.33±2.52bcd63.15±6.94Bb41.00±3.56Bbc 71.38±2.58Cde第8組 120.25±2.36Ccd 178.00±20.85Aa 17.67±2.08ab46.57±3.21Aa37.25±7.80ABbc 65.86±7.39BCbcd第9組 122.12±1.67Ccd 240.00±11.55Ccd 26.67±2.08bcd66.98±4.73BCb34.25±6.29ABab 61.12±4.84ABbc

2.3 受試樣品對便秘大鼠腸道菌群的影響

表3 受試樣品對便秘大鼠腸道菌群的影響(±s，n=4)Table 3 Effect of ructooligosaccharides and Lactobacillus on the intestinal flora of constipation rats (±s，n=4) lg(CFU/g)

表3 受試樣品對便秘大鼠腸道菌群的影響(±s，n=4)Table 3 Effect of ructooligosaccharides and Lactobacillus on the intestinal flora of constipation rats (±s，n=4) lg(CFU/g)

組別 腸球菌 大腸桿菌 乳酸桿菌 雙歧桿菌第1組5.63±0.16a4.14±0.31abc7.63±0.387.33±0.46ab第2組7.11±0.20d5.04±0.43d6.74±0.557.20±0.27ab第3組6.17±0.80abc 3.98±0.41ab6.76±0.507.04±0.10a第4組6.94±0.11cd 4.48±0.68bcd8.06±0.797.98±0.71b第5組5.82±0.32a3.57±0.60a7.51±0.897.83±0.43ab第6組5.99±0.63ab3.58±0.32a7.59±0.647.75±0.65ab第7組6.17±0.49abc 4.76±0.17cd7.24±0.777.86±0.35ab第8組6.87±0.37bcd 3.91±0.09ab7.18±0.916.96±0.59a第9組6.78±0.31cd4.91±0.27d7.40±0.377.86±0.35ab

由表3可知，各實驗組與第2組相比，有害菌腸球菌、大腸桿菌均表現下降的趨勢，受試樣品均在不同程度上抑制腸球菌、大腸桿菌的生長繁殖，其中第6、7組大鼠的腸球菌、大腸桿菌菌數顯著低于第2組(P＜0.05)，抑菌效果顯著；各組大鼠的乳酸桿菌、雙歧桿菌均差異不顯著，無統計學意義。說明受試樣品有抑制大鼠腸道有害菌生長繁殖的作用，對有益微生物的生長繁殖無不良影響。

3 討論與結論

番瀉葉作為通便藥物已應用多年[17]，而低聚果糖和乳酸桿菌制劑對便秘患者的潤腸通便作用哪個效果更好又健康，以及其最佳使用劑量仍有待探索。研究表明，番瀉葉浸劑具有增強胃腸道推進作用和抑制腸道吸收液體，促進腸液分泌，機械性刺激腸壁而使蠕動增強的作用[18]；低聚果糖在體內外均對雙歧桿菌有顯著地增殖作用，并在腸道內通過雙歧桿菌發酵，產生大量的短鏈脂肪酸，刺激腸道蠕動、增加糞便濕潤度并保持一定的滲透壓，從而防止便秘的產生，對產莢膜梭菌、大腸桿菌、艱難梭菌的生長有一定的抑制作用[19]；乳酸桿菌制劑則通過調節免疫、拮抗腸道致病菌等保持腸道微生態平衡，從而有益于維持宿主腸道正常功能[10-11]。

本實驗采用鹽酸洛派叮胺為便秘誘導劑，通過抑制腸道水分泌[20]和結腸蠕動[21]建立便秘模型，以番瀉葉浸劑為陽性對照組，探討不同劑量乳酸桿菌和低聚果糖的通便效果。結果表明不同劑量受試樣品均起到了維持便秘動物正常飲食和抑制腸球菌、大腸桿菌等有害菌生長繁殖的作用，對大鼠生長和腸道有益菌繁殖無不良影響；低聚果糖、乳酸桿菌對便秘大鼠的通便作用和抑制腸球菌、大腸桿菌生長繁殖的作用與番瀉葉相當，其中低聚果糖高劑量和乳酸桿菌低劑量組效果顯著，且二者的排便功能和對小腸運動的影響在實驗檢測的各項指標上差異不顯著；與番瀉葉浸劑相比，除小腸炭末推進率外，其他檢測指標均差異不顯著。綜上，為了避免長期使用番瀉葉出現副作用，綜合考慮通便效果與身體健康等因素，優先考慮無副作用的高劑量低聚果糖和低劑量乳酸桿菌制劑。

本實驗通過對比分析受試藥物對便秘大鼠的生長發育、排便功能、小腸運動和腸道菌群等方面的影響，證實低聚果糖和乳酸桿菌均具有潤腸通便的作用并對維持腸道菌群平衡、抑制腸球菌和腸桿菌的生長有較好功效，其通便功用大小與藥物劑量濃度有關，其中低聚果糖和乳酸桿菌分別于1.0g/(kg·d)和2.0×108CFU/(kg·d)時效果最顯著。

[1] 郭曉峰, 柯美云, 潘國宗, 等. 北京地區成人慢性便秘整群、分層、隨機流行病學調查及其相關因素分析[J]. 中華消化雜志, 2002, 22(10)： 637-638.

[2] 張虹璽. 養榮潤腸舒合劑對慢傳輸型便秘的治療作用及機理研究[D]. 沈陽： 遼寧中醫藥大學, 2009.

[3] 周景欣, 袁杰利, 遲俐, 等. 雙歧桿菌低聚果糖制劑對便秘人群腸道菌群的調整作用[J]. 中國微生態學雜志, 2006, 18(5)： 399-400.

[4] 陳朝文, 楊新慶. 便秘的診斷和治療[J]. 中國醫刊, 2003, 38(10)： 28-29.

[5] 四川恒泰醫藥有限公司. 便秘的藥物與治療進展[C]//四川恒泰醫藥有限公司，中國中醫肛腸教育研討會暨第十二屆中日大腸肛門病學術交流會論文集. 成都, 2008.

[6] 劉會艷, 郭劍, 李杰, 等. 西醫治療老年性便秘的研究進展[J]. 中國醫藥導刊, 2011, 13(7)： 1174-1176.

[7] 蒙君. 益生菌組合和合生元治療Wistar大鼠便秘型IBS模板探討[D]. 長沙： 中南大學, 2007.

[8] QUIGLEY E M M. The enteric microbiota in the pathogenesis and management of constipation[J]. The Journal of Pediatrics, Best Practice & Research Clinical Gastroenterology, 2011, 25(1)： 119-126.

[9] 任大勇, 李昌, 秦艷青, 等. 乳酸菌益生功能及作用機制研究進展[J]. 中國獸藥雜志, 2011, 45(2)： 47-50.

[10] 計惠民, 徐歸燕, 吉毅. 對便秘病人的護理援助[J]. 國外醫學護理學, 2001, 20(3)： 101-102.

[11] 褚慰, 付小林, 樊智慧, 等. 低聚果糖對便秘模型小鼠的通便功能的研究[J]. 中國藥物與臨床, 2010, 10(10)： 1135-1136.

[12] 劉協, 胡啟之, 李小寧, 等. 低聚果糖的潤腸通便功能研究[J]. 江蘇預防醫學, 2002, 13(1)： 62-63.

[13] CHEN Hsiaoling, LU Yuho, LIN Jiun, Jr, et al. Effects of fructooligosaccharide on bowel function and indicators of nutritional status in constipated elderly men[J]. Nutrition Research, 2000, 20(12)： 1725-1733.

[14] 鄭麗華, 賈蘭斯. 治療便秘藥物的合理選擇[J]. 中國臨床醫生雜志, 2007, 35(4)： 62-63.

[15] WINTOLA O A, SUNMONU T O, AFOLAYAN A J. The effect of Aloe ferox Mill. in the treatment of loperamide-induced constipation in Wistar rats[J]. BMC Gastroenterology, 2010, 11(1)： 95-96.

[16] 顧清, 楊溢, 江國虹, 等. 異麥芽低聚糖對腸道菌群的調節作用[J]. 衛生研究, 2003, 32(1)： 54-55.

[17] 杜思民. 慶大霉素番瀉葉果導片治療便秘的療效比較[J]. 中國中西醫結合消化雜志, 2001, 9(5)： 311-312.

[18] 相小燕. 番瀉葉浸劑灌腸治療產后便秘的療效觀察[J]. 海峽藥學, 2009, 21(8)： 139-140.

[19] 韓彥彬, 姚思宇, 李彬, 等. 低聚果糖促進腸道蠕動作用的實驗研究[J]. 中國熱帶醫學, 2009, 9(4)： 764-765.

[20] HUGHES S, HIGGS N B, TURNBERG L A. Loperamide has antisecretory activity in the human jejunum in vivo[J]. Gut, 1984, 25(9)： 931-935.

[21] SOHJI Y, KAWASHIMA K, SHIMIZU M. Pharmacological studies of loperamide, an anti-diarrheal agent[J]. Folia Pharmacol Japanese, 1978, 74(1)： 155-163.