球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1真核表達載體的構建

謝 翎1,2，黃 勃2

(1.安慶師范學院生命科學學院，安徽安慶 246011；2.安徽農業大學林學與園林學院，安徽合肥 230036)

酵母作為真核單細胞生物，兼有原核生物和真核生物的某些優點。與原核生物表達體系相比，利用酵母對外源基因進行真核表達具有諸多優勢：繁殖迅速，培養廉價；酵母結構簡單，便于進行異源基因的遺傳操作；具有蛋白翻譯后修飾能力[1]；可在信使RNA翻譯時去甲硫氨酸，避免藥物使用中產生免疫反應。目前技術最成熟，應用最多的酵母表達系統是畢赤酵母（Pichia pastoris）。

pPIC9K質粒含有kan基因，使畢赤酵母具有G418抗性。G418抗性水平主要依賴整合的kan基因的數目。kan基因與表達盒間具有遺傳連鎖，因此從G418抗性可推斷其所含有的插入基因拷貝數。

目前，國內外利用這種表達體系已成功表達多種異源蛋白[2-3]。但迄今為止，關于昆蟲病原真菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1在畢赤酵母中實現真核表達的研究還未見報道。本研究首次構建了球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1真核表達載體，為海藻糖-6-磷酸合成酶的蛋白研究及大規模發酵生產奠定了基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株與質粒

含球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1的質粒PMD18-T/Bbtps1，由實驗前期構建。分泌型真核表達穿梭載體pPIC9K與大腸桿菌JM109菌株由本實驗室保存。

1.1.2 試劑

TaqDNA聚合酶、PMD18-T載體、DNA膠回收試劑盒均購自大連寶生物公司。引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。其他常用試劑均為國產分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 Bbtps1基因的真核表達載體pPIC9K/tps1的構建

根據球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1序列及真核分泌型表達載體pPIC9K表達框及多克隆插入要求，設計上游引物TPS1BD1，下游引物TPS1BD2。通過PCR反應從質粒PMD18-T/Bbtps1（由前述實驗構建）中擴增出帶EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點的Bbtps1 cDNA全長序列。

下劃線部分序列分別帶有限制性內切酶EcoRⅠ和NotⅠ的識別位點。

根據特異引物TPS1BD1、TPS1BD2對PMD18-T/Bbtps1質粒進行擴增。

酶切后的酵母表達質粒pPIC9K與目的基因片段用T4 DNA連接酶連接，連接產物轉化宿主菌DH5α，轉化菌液涂布在含卡那霉素的LB平板上過夜，挑選陽性克隆子用插入基因特異引物TPS1BD1、TPS1BD2進行PCR鑒定并送測序。

1.2.2 大腸桿菌感受態細胞的制備

制備方法參照《Molecular Cloning》所介紹的CaCl2法[4]。

1.2.3 DNA回收及克隆、測序

在紫外燈下切下含目的片段的凝膠塊，用takara的膠回收試劑盒回收DNA?；厥掌伟丛噭┖姓f明書連接到PMD18-T載體上。大腸桿菌感受態細胞制備及克隆轉化具體方法參考《分子克隆實驗指南》。陽性轉化子委托上海英駿生物技術有限公司進行雙向測序。

1.2.4 序列分析

序列分析用DNAMAN軟件和NCBI網站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）上的BLAST程序完成。

2 結果與分析

在構建Bbtps1表達載體pPIC9K/tps1過程中，首先，擴增球孢白僵菌海藻糖-6-磷酸合成酶基因tps1 ORF的cDNA序列（1563bp，兩邊分別帶EcoRⅠ和NotⅠ酶切位點）。將其雙酶切后，通過T4連接與同樣經過雙酶切的質粒pPIC9K，構成質粒pPIC9K/tps1，轉化DH5α。通過引物TPS1BD1、TPS1BD2對重組質粒的大腸桿菌轉化子進行了PCR鑒定（圖1），同時挑取PCR鑒定正確的轉化子進行測序。序列分析結果表明，Bbtps1基因被正確地插入到pPIC9K質粒的表達框中。

圖1 重組質粒pPIC9K/tps1 PCR檢測

重組質粒pPIC9K/tps1全序列測定結果:

TGAAGCTTACGTAGAATTCATGTCCACCCCGGCAGAGACTCAGCAAGAGGCTGCTGCGCCCGGCCGTCTT CTGCTACTCTCGAACCGTCTGCTCATTGGCAGCTATACCTTTTCCATGTCCTCTGGTGGCCTTGTGACTGGCCTGA GCGGTCTGAGCAAGACCACCAGCTTCCAGTGGTGCGGATGGCCCGGCCTTGAGGTACCCGAGAACGAGGTCGA TGGCATGAAGAAACGCCTCAAAGCAGAGTACGGCGCGCATCCCGTCTTTATCGACGATGAGCTCGCTGACCGCC ACTACAATGGGTTTGCCAATTCTATCCTCTGGCCGTTGTTCCACTATCACCCCGGTGAAATCACCTTTGACGAGT CTGCCTGGGTCGCCTACCAAGAAGTCAACCGCCTCTTTGCGCAGACTGTCATCAAAGATGTTCAAGACGGTGAT CTAATCTGGGTGCACGACTACCATCTGATGCTTCTGCCCCAGATGTTGCGCGAGGAAATTGGCAACTCCAAGAA GAACGTCAAGATCGGCTTCTTTTTGCACACGCCATTTCCAAGTAGCGAAATTTACCGCATTCTGCCTGTCCGCGA GCCTCTTCTCACAGGTCTTCTCGATTGCGACCTGATTGGCTTCCACACATACGACTACGCGCGCCACTTCCTTAGT AGTTGCTCGCGCATACTCGGCACCCCCACCACCCCCAACGGTGTCGATTGGAATGGCCGCTTCGTGACTGTCGG GGCGTTTCCTATTGGAATAGACCCCGAAAAGTTTGTCGAGGGGTTGAAGCAACCCAAGGTGCAGGCGCGCATC GCAGCTCTGAAACGCAAGTTTGAAGGCGTGAAGCTCATTGTCGGCGTCGATCGTCTCGACTACATCAAGGGTGT GCCGCAAAAACTTCATGCCCTCGAGGTTTTCCTCACGGAGCACCCCGAGTGGATTGGCAAGATTGTCCTCGTCC AGGTTGCCGTGCCCTCACGCCAGGATGTCGAAGAGTACCAGAACCTGCGTGCCGTTGTCAACGAGCTCGTCGGC CGCATCAACGGCAAGTTTGGCACCATTGAATTTATGCCCATCCACTTTTTGCACCAGTCCGTGTCCTTTGACGAG CTGACGGCGCTCTACGCTGTGTCGGACGTGTGCCTGGTGTCTTCCACTCGTGATGGCATGAACCTCGTCTCGTAC GAGTACATTGCCACGCAGCGCGAGAAGCACGGCGTCATGATCCTCAGCGAGTTTACCGGCGCCGCGCAGTCGC TCAACGGCAGTCTGATTGTTAACCCCTGGAACACGGAGGAGCTAGCCAACGCCATCCACGACGCCGTGACCAT GAGCCCCGAGCAGCGCGCCGCCAACTACAGCAAGCTCGAGCGCTATGTCTTCAAGTACACGAGCGCTTGGTGG GGGGCCACCTTTGTCGCCGAGATGACGCGCCTCAGCAACGAGGAGTCGCAGGCAAAGACGATTCGCAATGTCT CGGGTGCCGTGGTCAGCTCGGGCCAAAAGGCACTGACAGAAGAGCCCGAGAACAAGGAGCCGGAGGCGAATC AAGCGGAATGAGCGGCCGCGAATTAATTCGCCTTAGACATGACT

兩個方框是使用的限制性酶切位點，陰影部分之間是插入的TPS1基因序列。限制性酶切位點之外，是原始質粒pPIC9K的序列。

3 討論

由于巴斯德畢赤酵母沒有穩定的附加體質粒，因此需要使用整合型質粒作為外源插入基因的表達載體。其表達載體通常包括AOX1啟動子（5’AOX1）、多克隆位點、AOX1轉錄終止子（AOXt）、組氨酸脫氫酶基因his4、3’AOX1以及來自大腸桿菌質粒pBR322的大腸桿菌復制序列。而整合位點一般位于HIS4區或AOX1區。巴斯德畢赤酵母用來表達外源基因，具有雜蛋白少、遺傳穩定等優點[5]。它能對插入基因編碼蛋白進行翻譯后修飾，并分泌至細胞外[6-7]。其表達蛋白能夠被糖基化，類似于人類蛋白質[8]，是一種較為理想的真核蛋白表達系統。

本研究針對球孢白僵菌的tps1基因,構建了其真核表達載體pPIC9K/tps1。通過PCR鑒定和測序表明，該重組質粒包含了球孢白僵菌tps1基因的全長cDNA序列。并且Bbtps1基因被正確地插入到了pPIC9K質粒的表達框中。因此，該重組質?？梢灾苯佑糜趖ps1基因的酵母表達。

[1]洪洄，王冬梅.應用酵母進行基因表達的研究進展[J].生物學通報，1999，34(7):12-14.

[2]CereghinoJL,CreggJM.Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].FEMSMicrobiology Reviews,2000,24:45-66.

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[5]Romanos M.Advances in the use ofPichia pastoris for high level gene expression[J].Current Opinion in Biotechnology,1995,6(5):527-533.

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[7]Sreekrishna K,Brankamp RG,Kropp KE,et al.Strategies for optimal synthesis and secretion ofheterologous proteins in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].Gene,1997,190(1):55-62.

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