小干擾RNA抑制成纖維細胞激活蛋白3的表達對肺癌干細胞增殖和侵襲的影響

張立凡 劉特

（1．復旦大學附屬華東醫院胸外科，上海 200040；2．上海中醫老年醫學研究所，上海 200031）

肺癌組織中存在耐藥性和自我增殖能力都非常強的腫瘤干細胞（cancer stem cells，CSCs）亞群，該亞群是肺癌細胞耐藥和肺癌治療后復發的主要原因之 一［1－2］。成纖維細胞激活蛋白 （fibroblast activation protein，FAP）家族包括 FAP1、FAP2 和FAP3，屬于Ⅱ型膜整合糖蛋白、絲氨酸蛋白酶家族。FAP具有體外二肽肽酶和膠原酶活性，可選擇性地表達于95%以上的肺癌間質成纖維細胞中，但是至今未見其表達于正常的成纖維組織和細胞的報道，FAP家族成員可能是增生性成纖維細胞的表面標志物［3－4］。研究siRNA靶向抑制肺癌CSCs中FAP3的表達，期盼闡明其對肺癌CSCs增殖和侵襲的影響。

1 資料與方法

1．1 細胞及主要試劑 人肺癌細胞株A549和siRNA－FAP質粒由復旦大學附屬華東醫院實驗室提供。四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）、二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、核糖核酸酶A（ribonuclease A，RNase A）購自美國Sigma公司。DMEM細胞培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）購自美國 Gibco公司。兔抗人CD44－異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）抗體、兔抗人CD133－藻紅蛋白（phycoerythrin，PE）抗體、兔抗人Ki67抗體及兔抗人3－磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）抗體購自美國CST公司。Trizol Reagent購自美國Invitrogen公司。逆轉錄及實時熒光定量聚合酶鏈反應試劑盒購自東洋紡（上海）生物科技有限公司。山羊血清、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的羊抗兔二抗購自北京博大泰克生物基因技術有限公司。蛋白質印跡（Western blot）試劑盒購自迪申生物（上海）有限公司。

1．2 肺癌CSCs篩選與培養 參考Gao［5］的方法，將A549細胞用DMEM培養基（內含10%FBS、青霉素100U／mL、鏈霉素100U／mL）于37℃、5%CO2環境中培養。選取處于對數生長期的細胞，用0．25% 胰蛋白酶－EDTA消化液消化細胞，離心收集細胞，分別加入2μL兔抗人CD44－FITC抗體和2μL兔抗人CD133－PE抗體，4℃孵育30min，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗1次，并重懸細胞。取500 μL細胞懸液（調整細胞濃度為2×107／mL），用流式細胞儀進行細胞分選，并收集CD44＋／CD133＋的肺癌CSCs。將肺癌CSCs分為3組：空白對照組（不轉染任何質粒）；siRNA－FAP組（轉染靶向沉默FAP3表達的siRNA質粒）；陰性對照組（轉染包含隨機序列的siRNA質粒）。

1．3 MTT比色法檢測CSCs增殖 將空白對照組、陰性對照組和siRNA－FAP組細胞接種于96孔細胞培養板中（2×103個／孔），置于37℃、5%CO2環境中培養，并分別于轉染12、24、48和72h后進行檢測。在檢測前4h加入MTT 20μL（5mg／L），繼續培養4h。離心去上清液并加入DMSO溶解沉淀。用酶標儀在490nm波長處讀取吸光度（OD值），設立3個復孔，取其平均值。借以各孔的OD值，計算出siRNA對肺CSCs的增殖抑制率。

1．4 實時熒光定量逆轉錄－聚合酶鏈反應（RTPCR）法檢測FAP3、Ki67的mRNA表達水平 按照Trizol Reagent說明書的步驟，抽提各組細胞的總RNA，并反轉錄為cDNA。以各組cDNA作為模板，采用兩步法進行，擴增產物以2%瓊脂糖凝膠進行電泳。各樣本重復3次實驗，以18SrRNA作為內參。目標片段的擴增引物序列為：Ki67上游引物5’－TGGGTCTGTTATTGATGAGCC－3’；Ki67 下游 引 物 5’－TGACTTCCTTCCATTCTGAAGAC－3’；FAP3上游引物5’－TCAGTGTGAGTGCTCTCATTGTAT－3’；FAP3 下 游 引 物 5’－GCTGTGCTTGCCTTATTGGT－3’；18SrRNA上游引物5’－CGTTGATTAAGTCCCTGCCCTT－3’；18SrRNA 下游 引 物 5’－TCAAGTTCGACCGTCTTCTCAG－3’。兩步法中退火溫度為58℃，擴增循環數為40個。

1．5 Western blot檢測蛋白表達量 于轉染72h后收集各組細胞，根據Western blot試劑盒說明書操作，采用BandScan軟件分析各條帶的灰度值。

1．6 軟瓊脂克隆集落形成實驗檢測肺癌CSCs的侵襲能力 在42℃水浴中，將貯存濃度為1．2%的低熔點瓊脂糖與細胞完全培養基（濃度為原始培養基的2倍）等體積混合，形成終濃度為0．6%的底層瓊脂，取1．4mL加入6孔板的1個孔中。待瓊脂完全凝固后，取對數期細胞吹打成單細胞懸液，并調整細胞濃度為2×104／mL。再將貯存濃度為0．6%的低熔點瓊脂糖與細胞完全培養基（濃度為原始培養基的2倍）等體積混合，形成終濃度為0．3%的上層瓊脂。取1．0mL上層瓊脂與0．1mL細胞懸液充分混勻，加入已有下層瓊脂的6孔板中，待其凝固后，置于37℃、5%CO2的細胞培養箱中培養3周，計算細胞克隆集落形成率。

2 結 果

2．1 靶向FAP3表達的siRNA對肺癌CSCs體外增殖的影響 見表1。

表1 MTT比色法檢測細胞增殖抑制率（%，±s）

表1 MTT比色法檢測細胞增殖抑制率（%，±s）

注：與其他2組相應培養時間時的細胞增殖抑制率比較，＊P＜0．05，＊＊P＜0．01

轉染后培養時間（h）空白對照組（n＝6）siRNA－FAP3組（n＝6）陰性對照組（n＝6）0 0 0 0 12 1．26±0．06 2．59±0．13 0．23±0．18 24 1．22±0．15 5．89±0．29 1．79±0．37 48 2．34±0．41 24．67±1．08＊ 3．76±0．88 72 3．28±0．65 53．98±3．75＊＊4．53±1．01

2．2 siRNA抑制FAP3及增殖相關基因的mRNA表達 各組細胞培養72h后，siRNA－FAP組細胞中FAP3和Ki67基因mRNA的表達水平（0．32±0．06，0．18±0．02）顯著低于陰性對照組（1．03±0．12，0．99±0．17）和空白對照組（1．02±0．09，0．97±0．11），差異有統計學意義（P＜0．01）。由此可見，siRNA可以有效地抑制細胞內FAP3基因的表達，下調腫瘤增殖基因Ki67的轉錄。

2．3 siRNA對肺癌CSCs中增殖相關蛋白表達的影響 各組細胞培養72h后，siRNA－FAP組細胞中FAP3和 Ki67蛋白表達水平（0．16±0．05，0．25±0．09）顯著低于陰性對照組（0．49±0．26，0．47±0．13）和空白對照組（0．59±0．27，0．63±0．22），差異有統計學意義（P＜0．05），見圖1。以上結果表明，siRNA可有效抑制CSCs內FAP3蛋白的表達，下調腫瘤增殖基因Ki67蛋白的表達，從而抑制肺癌CSCs的體外增殖。

圖1 Western blot檢測Ki67和FAP3蛋白的表達

2．4 靶向FAP3的siRNA對肺癌CSCs侵襲的影響 將各組細胞以低密度接種于軟瓊脂培養基時，siRNA－FAP組 細 胞 的 克 隆 形 成 率 ［（13．09±5．21）%］顯著低于陰性對照組［（77．59±8．29）%］和空白對照組［（83．86±10．11）%］，差異有統計學意義（P＜0．01）。而陰性對照組與空白對照組細胞克隆形成率比較，差異無統計學意義（P＞0．05）。以上結果表明，靶向抑制FAP3的表達可以有效地削弱肺癌CSCs在體外基質中的遷移與侵襲能力。

3 討 論

自從在淋巴瘤細胞中首次發現CSCs以來，已經在許多腫瘤組織（如肺癌、肝癌、乳腺癌、卵巢癌等）中找到了CSCs。肺癌CSCs高表達CD44和CD133蛋白，且具有很強的化療藥物耐受性和自我增殖能力。另一方面，肺癌基質成纖維細胞通過分泌一定的生長因子來促進腫瘤細胞的增殖和侵襲，為肺癌細胞的生長和浸潤提供了有利的條件。有研究［6］表明，FAP在多種惡性上皮性腫瘤的間質中呈現高表達的態勢，其過度表達可以促進局部腫瘤細胞增殖及轉移。Rettig等［6］研究發現，FAP1和FAP2在核酸序列上與T細胞活化表面抗原CD26具有很高的同源性，但是其表達的部位與功能卻不盡相同。目前FAP3與腫瘤之間的關系尚不明了，對其的研究也尚少。基于此，我們以肺癌CSCs作為研究對象，研究siRNA抑制FAP3基因的表達對肺癌CSCs的影響。結果表明，當FAP3表達被顯著抑制后，肺癌CSCs的體外增殖速度明顯減緩，其侵襲性因此而阻滯。此外，當FAP3基因表達受抑制之后，細胞增殖因子Ki67的表達顯著下調。體外實驗結果充分說明，FAP3的表達對肺癌CSCs的增殖和侵襲具有顯著的影響，當FAP3被抑制后，肺癌CSCs的自我增殖和轉移能力都會受到影響。

綜上所述，采用siRNA技術可以有效抑制肺癌CSCs中FAP3的表達，并抑制CSCs的惡性行為。

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