2型糖尿病患者外周血漿中熱休克蛋白70抗體的變化

戚筠 楊楊

（武漢科技大學附屬天佑醫院內分泌科，湖北武漢 430064）

目前研究認為，2型糖尿病（type 2diabetes mellitus，T2DM）的發生和發展是遺傳因素和環境因素共同作用的結果，其中氧化應激是T2DM發病的核心因素。熱休克蛋白70（heat shock protein 70，HSP70）在應激狀態下高度表達，它可參與免疫反應，具有抗細胞凋亡、抗氧化功能，而且可以提高細胞的應激耐受性，故可保護胰島β細胞在應激狀態時免遭損害。本研究旨在通過對T2DM患者外周血漿中HSP70抗體水平的檢測，進一步了解HSP70及其抗體與T2DM的關系。

1 資料與方法

1．1 一般資料 2009年1月—2010年12月在我院確診為T2DM的112例患者為T2DM組，年齡35～65歲，平均年齡（54．15±11．81）歲；男性65例，女性57例。選取同時間段在我院體檢的110例健康人為對照組，年齡32～62歲，平均年齡（52．93±11．24）歲；男性70例，女性40例。

1．2 血漿HSP70抗體滴度的檢測 采用蛋白質免疫印跡－酶聯免疫吸附法（Western blot－ELISA），基本步驟如下：將細菌表達的重組人類HSP70抗原經10%十二烷基磺酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）電泳分離，電轉移至硝酸纖維素（nitrocellulose filter membrane，NC）膜；切下含 HSP70抗原的NC膜條并裁成2mm×2mm的膜片，分裝入96孔酶標板，每孔加入200μL磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗30min，吸去PBS后加入5%脫脂奶粉于37℃飽和封閉1h；按1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀釋待檢血漿，各加入200μL稀釋液于酶標孔中，記錄加樣順序。4℃孵育過夜，棄去稀釋血漿，加入200μL Tris緩沖液（TBS）洗滌10min，重復6次。每孔加入200μL 1∶500稀釋的辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗人IgG，37℃孵育育2h。200μL TBS洗滌10min，重復8次。100μL DAB顯色液顯色5～10min，37℃溫育可加快顯色速度。

結果判斷：終止顯色，陽性結果為NC膜一面的中間有一條肉眼可見的棕色條帶，另一面則沒有或極弱。陰性則無棕色條帶。

1．3 統計學處理 對兩組患者的年齡進行非配對t檢驗，采用χ2檢驗分析性別構成比、HSP70抗體陽性率，采用非條件Logistic回歸分析HSP70抗體與T2DM的關系。P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 T2DM組與對照組HSP 70抗體的檢測結果T2DM組與對照組HSP70抗體陽性例數分別為36例和9例，兩組差異有統計學意義（P＜0．05），不同滴度HSP70抗體的陽性例數在兩組之間差異均有統計學意義（P＜0．05）。見表1。

表1 兩組HSP70抗體的檢測結果n（%）

2．2 HSP70抗體與T2DM的關系 針對HSP70抗體與T2DM關系的非條件多元Logistic回歸分析結果見表2。

表2 T2DM危險因素的非條件Logistic回歸分析

3 討 論

熱休克蛋白（heat shock proteins，HSPs）是一組在進化上高度保守的蛋白質，按其分子量大小可分為 HSP90－100、HSP70、HSP60、小分子 HSP及泛素等幾個家族。其中HSP 70家族因具有廣泛的生物學功能而成為當今生命科學研究中的熱點［1］。

HSP的“分子伴侶”功能己被人們所了解，它通過與多種具有不同功能的蛋白質在細胞中形成復合體而參與有關蛋白的折疊、亞基的組成、細胞內運輸及蛋白質降解等過程，保護細胞免受損傷和其它應激的影響［2］。HSP70亦參與炎性反應與免疫應答。一旦機體由于化學和物理因素的刺激導致HSP的高表達，T細胞免疫和體液免疫就被激活，產生HSP70抗體，誘發針對機體的炎性反應和免疫反應［3］。目前許多研究［4］提示，HSP抗體與疾病的發生、治療或預后有關。鄔堂春等［5］發現，血漿中HSP70抗體的出現與多種疾病（如中暑、苯中毒、高血壓、免疫性疾病等）有關。但是關于抗人HSP抗體在T2DM患者中是否存在，以及其與T2DM發病的關系，目前研究尚少見。

本研究結果顯示，112例T2DM患者中抗HSP70抗體陽性36例，110例對照組中抗體陽性9例，兩組抗體陽性率比較差異有統計學意義（P＜0．05）。Logistic回歸分析顯示，抗HSP70抗體是T2DM的獨立危險因素。

本研究結果提示，HSP70抗體與T2DM發病相關，但是關于HSP70抗體如何影響T2DM發病原因尚不明確，有待進一步研究。

［1］ Weng D，Calderwood SK，Gong J．Preparation of a heat－shock protein 70－based vaccine from DC－tumor fusion cells ［J］．Methods Mol Biol，2011，787：255－265．

［2］ Gobbo J，Gaucher－Di－Stasio C，Weidmann S，et al．Quantification of HSP27and HSP70molecular chaperone activities［J］．Methods Mol Biol，2011，787：137－143．

［3］ Borges TJ，Wieten L，van Herwijnen MJ，et al．The anti－inflammatory mechanisms of Hsp70［J］．Front Immunol，2012，3：95．

［4］ Wu T，Chen S，Xiao C，et al．Presence of antibody against the inducible Hsp71in patients with acute heat－induced illness［J］．Cell Stress Chaperones，2001，6（2）：113－120．

［5］ 鄔堂春，賀涵貞，張國高．熱應激蛋白研究的進展與前景［J］．中華預防醫學雜志，2000，34（1）：6－7．