星點設計-效應面法優化α-細辛腦脂質體噴鼻劑的制備工藝Δ

陳穎，黃海潮，朱慶玲，祝紅，伍善廣（.廣東食品藥品職業學院，廣州50520；2.柳州醫學高等?？茖W校，廣西柳州 545006）

α-細辛腦（α-Asarone，ARE）是天南星科植物石菖蒲的主要活性成分之一，又名α-細辛醚、細辛醚和細辛腦（Asarone）[1]。可用于止咳、化痰、平喘，對肺炎、慢性氣管炎、支氣管哮喘均有較好的療效[2-3]。細辛腦為脂溶性極強的化合物，制成生物利用度高的口服固體制劑有一定困難。文獻報道細辛腦膠囊劑絕對生物利用度僅為2.7%，片劑絕對生物利用度也很低，僅9.7%[4]。效應面法（Response surface methodology，RSM）是統計與設計試驗技術相結合的方法[5-6]，與正交設計和均勻設計相比，效應面法可用非線性數學模型擬合，預測試驗結果[7]。

筆者采用星點設計（Central composite design，CCD）-效應面法優化ARE脂質體噴鼻劑的制備工藝，用乙醇注入法[8]將細辛腦包入脂質體，制備成噴鼻劑，達到肺部直接給藥，對于提高細辛腦治療肺部疾病的效果與細辛腦的生物利用度有重要意義。

1 材料

DF-101S集熱式磁力攪拌器（金壇市晶玻實驗儀器廠）；FJ-200高速分散勻質機（上海標本模型廠制造）；島津高效液相色譜儀，包括LC-10AT泵、SPD-10A紫外檢測器（日本島津公司）；Nano-ZS 90粒徑測定儀（英國馬爾文公司）；JEM.100CX型透射電鏡（日本日立公司）。

ARE對照品及原料藥（廣西億康藥業股份有限公司，批號：080626，純度：98.6%）；卵磷脂（德國利保益有限公司，批號：1032917）；膽固醇（上海藍季科技發展有限公司，批號：100918）；維生素E（武漢銀河化工有限公司，批號：20091015）；Sephadex-G50（上海源聚生物科技有限公司，進口分裝）；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 單因素試驗

精密稱取卵磷脂、膽固醇、維生素E，置于小燒杯中，加入適量的恒溫無水乙醇，攪拌使溶解，再加入ARE，攪拌混勻。慢慢勻速注入水浴恒溫的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，攪拌30 min，水浴保溫50 min，放置1 h使其充分水合，用高速分散勻質機以5 000 r/min勻質3次，每次10 min，分裝至噴霧器中，冷處保存，即得ARE脂質體噴鼻劑。單因素試驗以制劑在顯微鏡下觀察的形態、放置是否分層以及包封率為主要指標進行考察。

2.1.1 磷脂含量的影響。磷脂是脂質體成膜的主要成分，本試驗考察了1%～8%的磷脂含量。結果當磷脂含量達6%時，脂質體就會出現不同程度的析出；而磷脂含量過低，則會不利于包封率的提高；當磷脂含量在3%～5%時，穩定性和包封率都較高；磷脂含量為4%時，包封率最高。磷脂含量對包封率的影響結果見圖1。

圖1 磷脂含量對包封率的影響結果Fig1 Effects of phospholipid content on entrapment efficiency

2.1.2 膽固醇含量的影響。膽固醇是膜固化的重要成分，本試驗以磷脂-膽固醇之比固定膽固醇的含量，考察了磷脂-膽固醇為1∶1～10∶1的比例。結果當膽固醇含量過低，會影響脂質體的成膜性；當磷脂-膽固醇之比達10∶1時，脂質體容易出現絮凝或沉淀現象；磷脂-膽固醇之比在4∶1～8∶1時，穩定性和成膜性較佳。膽固醇含量對包封率的影響結果見圖2。

圖2 膽固醇含量對包封率的影響結果Fig2 Effects of cholesterol content on entrapment efficiency

2.1.3 PBS pH值的影響。本試驗考察了pH值為6.3、6.5、6.8、7.0、7.2的PBS。試驗結果表明，pH值對脂質體的包封率影響不大，但是對脂質體的穩定性影響比較大，pH 6.8、7.0的PBS制備的脂質體穩定性較好?？紤]到pH 6.8更接近鼻腔pH值[9]，故選擇PBS的pH值為6.8。

2.1.4 投藥量的影響。本試驗以磷脂-藥物之比固定投藥量。結果，隨著ARE的投藥量的增加，包封率呈上升趨勢；但當磷脂-ARE之比小于30∶1時，顯微鏡下觀察可見不同程度的晶體，且包封率呈降低趨勢。投藥量對包封率的影響結果見圖3。

2.1.5 維生素E用量的影響。維生素E有抗氧化的作用，有利于脂質體的穩定性，但如果用量太大，反而會加速脂質體的絮凝與析出。當維生素E含量為0.1%（W/W）時，顯微鏡觀察無油滴析出，且脂質體穩定性最好。

2.1.6 水浴溫度的影響。制備溫度對制劑影響較小，考慮到高溫可加速磷脂和藥物的氧化，通過試驗且參考有關文獻[10]，將制備溫度控制在55℃左右。

2.2 中心組合優化設計

綜合單因素試驗結果，選取磷脂含量（X1），磷脂-膽固醇之比（X2）和磷脂-藥物之比（X3）3個因素，采用3因素5水平效應面分析方法，星點設計因素水平見表1。

表1 星點設計因素水平Tab1 Levels and factors of central composite design

2.3 包封率的測定[11]

2.3.1 色譜條件。采用高效液相色譜法測定ARE含量。色譜柱：Agilent Hypersil ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（65∶35，V/V）；流速：1.0 ml/min；紫外檢測波長：313 nm；進樣量：20 μl。

2.3.2 標準曲線的繪制。精密稱取ARE對照品10 mg，置于50 ml量瓶中，加甲醇-水（65∶35，V/V）溶解并稀釋至刻度，搖勻，得ARE對照品貯備液。精密量取該貯備液0.4、1.6、3.2、4.0、5.0、6.0 ml分別置10 ml量瓶中，加甲醇-水（65∶35，V/V）稀釋至刻度，搖勻。分別取上述溶液各20 μl，進樣，記錄色譜圖。以峰面積（A）對質量濃度（c）進行回歸分析，得方程A＝40 040c+50 817（r＝0.999 5，n＝5）。結果表明，ARE在8～120 μg/ml檢測質量濃度范圍內與峰面積積分值線性關系良好。

2.3.3 精密度和重復性試驗。取“2.3.2”項下64 μg/ml的溶液，重復進樣6次，測定峰面積，計算得出RSD＝0.32%（n＝6），表明進樣精密度良好。取同一批ARE脂質體5份，按“2.3.5”項下方法，測定ARE的含量，結果RSD＝1.11%（n＝5），表明該含量測定方法重復性良好。

2.3.4 穩定性試驗。取同一供試品溶液，室溫放置0、1、2、4、6、8 h后分別測定ARE的含量，結果RSD＝0.92%（n＝6），表明供試品溶液在8 h內基本穩定。

2.3.5 加樣回收率試驗。將一定量的ARE對照品貯備液與空白脂質體按一定比例混合成50%、60%、70%的ARE濃度，加入一定量的甲醇破乳，用甲醇-水（65∶35，V/V）稀釋的樣品各3份，按“2.3.1”條件進行測定，計算回收率。結果平均回收率為98.21%，RSD＝1.16%（n＝9）。

2.3.6 凝膠柱分離測定脂質體中游離藥物。吸取1 ml的脂質體，上樣于已用pH 6.8 PBS平衡好的Sephadex-G50柱（1.6 cm×50 cm）上，用pH 6.8 PBS洗脫，流速為1.0 ml/min。分次收集洗脫液，每次5.0 ml，通過觀察流動吸光度的變化監測脂質體與藥物的分離情況。收集游離藥物，按“2.3.1”條件測定藥物質量濃度。

2.3.7 柱回收率考察。吸取“2.3.5”的高、中、低濃度的ARE對照品與空白脂質體的混合液各1 ml，按“2.3.6”項下的條件進行試驗，測得柱加樣回收率平均值為98.5%。配制高、中、低濃度的ARE對照品溶液，吸取1 ml，同法測定。結果ARE柱回收率平均值為99.2%。

2.3.8 包封率的計算。精密量取ARE脂質體0.2 ml，置于25 ml容量瓶中，加入一定量的甲醇破乳，搖勻，待溶液完全澄清透明后用甲醇-水（65∶35，V/V）稀釋至刻度，搖勻，按“2.3.1”條件進行測定，求出脂質體中ARE的含量。精密量取ARE脂質體混懸液1 ml，按“2.3.6”項下的條件進行試驗，測定游離藥物的量。按下式計算包封率[12]：

包封率（%）＝（W總－W游）/W總×100%（W總：總藥物量，W游：未包入脂質體的游離藥物量）

2.4 星點設計-效應面法優化處方[13-14]

以包封率（Y）為評價指標進行試驗，設計及結果見表2，回歸模型各項方差分析表3。

表2 星點設計及結果Tab2 Central composite design and its results

根據試驗結果，應用Design-Expert?8.0軟件，進行二次多項式逐步回歸擬合，得到模型為：Y＝65.48+4.02X1+6.63X2+2.19X3－0.051X1X2+1.27X1X3－1.01X2X3－5.68X12－3.95X22－

表3 回歸模型各項方差分析Tab3 Analysis of variance for fitted regression model

從表3方差分析結果可見，試驗模型具有高度的顯著性（P＜0.01）。X1、X2對包封率影響顯著（P＜0.05）；交互項X1X2、X1X3、X2X3的P值均大于0.05，說明這3個因素之間的交互作用不大。R2＝0.907 4，說明模型能夠很好地反映響應值的變化，擬合度好。可以用此模型來分析和預測ARE脂質體的工藝結果。

各因素的交互結果見圖4。

圖4 不同因素組合對包封率影響的曲面圖A.Y＝f（X1，X2）的效應面圖；B.Y＝f（X1，X3）的效應面圖；C.Y＝f（X2，X3）的效應面圖Fig4 Response surfaces of the effects of different factors on entrapment efficiencyA.response surface of Y to X1and X2；B.response surface of Y to X1and X3；C.response surface of Y to X2and X3

由圖4可見，磷脂-膽固醇之比對脂質體包封率影響較為顯著，表現為曲線較陡，最佳值為7.59；磷脂-藥物之比影響較小，曲線較為平滑，最佳值為43.32。

2.5 最優處方工藝驗證

通過Design-Expert?8.0軟件，結合表3方差分析的結果，在得到最大包封率的同時綜合考慮工業可行性和投入產出比，選取ARE脂質體最佳制備工藝：磷脂含量4.5%、磷脂-膽固醇之比7.5、磷脂-藥物之比45。按照選取的最佳工藝條件重復3次試驗，將預測值與實測值進行比較并計算偏差[偏差＝（預測值－實測值）/預測值×100%]，結果見表4。

表4 驗證試驗結果（n＝3）Tab 4Results of validation test（n＝3）

由表4可見，預測值與實測值的偏差為1.73%，說明采用效應面分析法得到的工藝準確可靠。

2.6 脂質體形態觀察

對最優工藝制備的脂質體進行粒徑、Zeta電位測定，電鏡掃描表面形態。經激光粒度分析儀測定，ARE脂質體粒徑主要集中在200 nm波長處，ARE脂質體的的粒徑分布見圖5；Zeta電位為－24.9 mV；用透射電子顯微鏡觀察并拍攝照片，ARE脂質體的掃描電鏡圖見圖6。

圖5 ARE脂質體的的粒徑分布Fig5 Distribution of particle size ofARE liposome

圖6 ARE脂質體的掃描電鏡圖（×27 000）Fig6Scanning electron micrograph ofAREliposome（×27000）

由圖6可見，不同粒徑的脂質體形態完整，雙分子膜結構清晰，均屬于單室脂質體，脂質體內部包裹有細辛腦使脂質體在透射電鏡下顏色變亮，脂質體的相互分界明顯。

3 討論

脂質體肺部給藥具有吸收迅速、刺激性小、耐受性好、安全性高，可實現持續緩慢釋藥、生物利用度高等優點。脂溶性藥物在水中的溶解性差，肺部溶解量有限；制成脂質體后，可改善溶解性，從而提高有效藥物濃度。乙醇注入法制備脂質體是最簡單的制備方法之一，該方法操作簡便、設備簡單、重現性好，適合于大規模工業生產的需要。將ARE制成脂質體，經噴霧器霧化實現鼻腔給藥，吸入肺部，在治療肺局部疾?。ㄈ缦?、肺氣腫及囊性纖維化等）時，使藥物直接濃集于病灶區，起效快、劑量低、作用時間長、進入體循環的藥量小、不良反應少。

星點設計-效應面法是比較適宜進行非線性擬合的優化法。結果表明該組數據代入最佳模型方程獲得的理論預測值與實測值比較吻合，證實所建立的數學模型具有較好的預測性。此外，通過最優處方工藝驗證試驗證明，所得處方工藝包封率高、重現性較好，達到了優選處方工藝的目標。

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