遼東楤木協同順鉑抑制SKOV3－DDP生長的作用及機理

王春梅，薛曉鷗，張廣美

(1.北京中醫藥大學東直門醫院，中西醫結合博士后流動站，北京 100700;2.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700;3.哈爾濱醫科大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150001)

卵巢癌是惡性度及致死率最高的婦科腫瘤［1］，五年生存率不到45%。以鉑類為主的化學治療為其主要的治療手段之一。雖然鉑類初始使用臨床效果顯著，但隨療程的增加，腫瘤細胞逐漸對其產生耐受性［2］，鉑類耐藥成為影響卵巢癌化療療效及患者預后的主要因素。因此，尋求一種增強鉑類化療效果或降低鉑類耐藥的方法十分重要。

遼東楤木(Aralia elata(Miq.)Seem)，是東北地區餐桌上常見的山野菜，為五加科楤木屬多年生亞喬木植物，又名龍牙楤木、刺嫩芽、刺老芽等。中醫學認為其具有補腎填精的功效。在前期的實驗中我們發現在遼東楤木葉中提取的皂苷類物質可抑制卵巢癌SKOV3細胞及卵巢癌耐順鉑株SKOV3－DDP細胞的生長［3］，并能夠降低耐藥蛋白的表達［4］。本課題旨在探討遼東楤木葉總皂苷(Total aralosides isolated from the leaves of Aralia elata(Miq.)Seem ，TALAS)是否具有協同順鉑、抑制SKOV3－DDP細胞生長的作用并探尋其可能的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗用細胞系及培養方法 卵巢腺癌順鉑耐藥株(SKOV3－DDP，中國醫學科學院腫瘤研究所，批號zk－2010)。培養條件:細胞培養于含10%胎牛血清(NQBB，澳大利亞)的RPMI－1640培養液中，其中加入0.1%青 － 鏈霉素、0.3%谷氨酰胺，于37℃、5%CO2恒溫培養箱培養，每隔3天傳一代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.2 實驗藥品及試劑 遼東楤木葉總皂苷(TALAS)，粉末狀、褐色、易溶于水，常溫保存，由黑龍江中醫藥大學中藥化學教研室匡海學教授2010年贈送，用含10%胎牛血清的RPMI－1640培養液配成1 000ug/ml母液，－20℃保存，根據實驗需求配成相應濃度;順鉑(齊魯制藥，批號990619)，用生理鹽水配成液體，4℃保存;RPMI－1640培養液(HyClone，美國);胎牛血清(NQBB，澳大利亞);蛋白分子量標準(江蘇碧云天);Annexin－V FITC/PI凋亡檢測試劑盒(江蘇碧云天);Phospho－iκB －α(Ser32)抗體(CST，美國);Phospho－iκκα(Ser176)(CST，美國);Phospho－ NF －κBp65(Ser536)(CST，美國);內參 β －actin、馬抗小鼠二抗、羊抗兔二抗(SANTA CRUZ，美國);MTT、DMSO、PI、RNase A(Sigmal，美國);PCR 引物(上海生工，內參 GAPDH:上游:5'－ gtcagtggtggacctgacct－3'、下游5'－ aggggtctacatggcaactg － 3'，LRP(lung resistance protein)5'－acaagacccgtgtggttagc－3'、下游:5'－agagggacaacacggtgaac－3');RT－PCR反應試劑盒(大連寶生物)。

1.3 實驗耗材及儀器設備 細胞培養瓶、細胞培養板、槍頭等耗材(corning，美國);DYY－12型電泳儀(北京六一儀器廠);GDS－8000凝膠成像儀(UVP，美國);流式細胞儀(BD，美國);多功能酶標儀(Biotek，美國);熒光倒置顯微鏡(德國蔡司Zeiss公司);紫外分光光度計(島津，日本);逆轉錄－PCR反應儀(百維信生物);藍盾552可見光凝膠電泳透射儀(廈門百維信生物)。

2 實驗方法

2.1 MTT法檢測TALAS、順鉑對 SKOV3－DDP細胞的協同抑制作用

在前期實驗中，已通過MTT法證實TALAS對SKOV3－DDP細胞的抑制作用，在本實驗中仍采用MTT法檢測TALAS與順鉑在抑制耐藥細胞生長中的協同作用。取對數生長期SKOV3－DDP細胞，以5×103個/孔接種于96孔培養板中，分為順鉑組(50umol/l)、TALAS(100ug/ml)組、順鉑 +TALAS組(50umol/l+100ug/ml)、陰性對照組(培養液)，每組設五個復孔，周邊孔用PBS填補。37℃，5%CO2恒溫培養箱培養24h后，吸盡液體，PBS沖洗后，每孔加入300ul液體，混合藥液組兩種藥液各加入150ul，培養24h后，MTT法檢測細胞活性，根據公式計算抑制率。

2.2 Annexin－V FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡

選擇對數生長期SKOV3－DDP細胞，經胰酶消化后，制成單細胞懸液，細胞計數板計算濃度。以3×105個/孔，種植于6孔細胞培養板中，每孔加入2ml完全培養液，37℃、5%CO2恒溫培養箱中培養24h。將細胞分為對照組、TALAS低劑量組(50ug/ml)、TALAS中劑量組(100ug/ml)、TALAS高劑量組(200ug/ml)。吸出上清液，根據分組加入不同濃度藥液各2ml，37℃、5%CO2恒溫培養箱中繼續培養24h。Annexin－V FITC/PI凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡(按說明操作)。實驗重復3次。凋亡率用(mean±SEM)表示，組間比較用t檢驗，用SPSS 13.0進行統計分析，P＜0.05為具有顯著性差異。

2.3 RT－PCR檢測LRP mRNA表達

細胞處理及實驗分組同上，收集各組細胞，提取總RNA，根據引物及反應條件逆轉錄合成cDNA，按反應條件進行PCR反應，然后將PCR反應產物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈觀察凝膠并照相，實驗重復3次，條帶分析軟件分析實驗結果。

2.4 WB法檢測NF－B信號傳導通路蛋白質磷酸化水平

細胞培養、藥物干預及分組同上實驗，收集各組細胞，磷酸化蛋白提取試劑盒提取各組細胞蛋白質，檢測蛋白質含量，計算上樣量，經過聚丙烯胺凝膠電泳、轉膜等過程，將蛋白質轉至NC膜上，然后進行免疫反應。一抗稀釋濃度:Phospho－iκB－α(Ser32)抗體:抗體稀釋液 =1∶800，Phospho － iκκα:抗體稀釋液 =1∶1 000，Phospho－NF －κB:抗體稀釋液 =1∶750，渦旋混勻。內參β－actin:抗體稀釋液=1∶500。馬抗小鼠二抗稀釋濃度為1∶500，羊抗兔二抗稀釋濃度為1∶1 000。免疫反應后，堿酶法顯影、定影，實驗重復3次，照相并分析結果。

3 實驗結果

3.1 TALAS、順鉑抑制SKOV3－DDP細胞生長的協同作用

經過24h的作用后，順鉑組(50umol/l)細胞抑制率達到(54.37 ±1.27)%，TALAS 組(100ug/l)抑制率為(45.67±2.34)%，順鉑 +TALAS(69.26±2.34)%。結果顯示，TALAS與順鉑有明顯的協同作用，可增強順鉑對SKOV3－DDP細胞的抑制作用。

3.2 Annexin－V FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡

用Annexin－V FITC/PI雙染法檢測TALAS誘導SKOV3－DDP細胞發生凋亡的作用，結果如圖1A所示:正常對照組早期凋亡的細胞僅占細胞總數的(0.85±0.13)%;TALAS低劑量組作用24h后，早期凋亡細胞的比率上升到(8.1±0.34)%;TALAS中劑量組及高劑量組早期凋亡細胞含量進一步上升，分別為(14.9 ±0.85)%、(28.7 ±0.45)%。如圖1B 所示:與正常組相比，中、高劑量組早期凋亡率具有顯著性差異(P ＜0.05，P ＜0.01)。

3.3 TALAS對LRP mRNA水平的影響 結果見表1。

表1 TALAS對LRP RNA水平的影響(mean±SEM，n=3)

如圖2所示，左側為內參GAPDH組，右側為LRP組，從左至右分別為對照組、TALAS低劑量組(50ug/ml)、中劑量組(100ug/ml)、高劑量組(200ug/ml)，分別作用24h后，細胞內LRP及內參GADPH的表達情況，條帶灰度代表mRNA表達水平的高低。如表1所示:將對照組灰度設置為1，其他各組為相對于正常組的灰度值，將各組條帶灰度值與相應組內參GADPH的灰度值相比，結果如表1所示:與對照組相比，高濃度組差異顯著(P＜0.05)，低濃度、中濃度組無顯著性差異。

3.4 WB法檢測NF－κB信號傳導通路蛋白質磷酸化水平 結果見圖3、表2。

表2 TALAS 對 Phospho－iκB － α、Phospho－ iκκα、Phospho－NF－κB蛋白質表達的影響(mean±SEM，n=3)

圖1 Annexin－V FITC/PI雙染法檢測不同濃度TALAS作用24h后早期凋亡率的變化

圖2 RT－PCR法檢測TALAS對SKOV3－DDP細胞LRP mRNA水平表達的影響

圖3 WB 法檢測 TALAS對 Phospho－iκB － α、Phosphoiκκα、Phosphoκ －NF － κB 蛋白質表達水平的影響

如圖3所示，從左至右為正常細胞對照組、TALAS低劑量組(50ug/ml)、中劑量組(100ug/ml)、高劑量組(200ug/ml)分別作用于SKOV3－DDP細胞24h后，Phospho－iκκB － α、Phospho－iκκα、Phospho－NF － κB及內參β－actin蛋白質的表達情況，條帶灰度代表蛋白質表達水平。

如表2所示，將正常組的灰度值設置為1，其他各組為相對灰度值，與正常組相比，中濃度組及高濃度組P－iκB－α表達水平顯著降低，具有統計學意義(P＜0.05，P ＜0.01);高濃度組 P －iκκα、P －NF － κB 表達水平下調，與正常組相比具有顯著性差異(P＜0.01)，低、中劑量組與正常組相比差異不顯著(P＞0.05)。

4 討論

鉑類耐藥是卵巢癌治療過程中的嚴重問題，解決鉑類耐藥對于卵巢癌患者意義重大。順鉑是一種中性的、正方形Pt(CN)配合物，含有兩個氯離子配體并處于順位。其主要作用機制是對DNA復制、RNA轉錄的抑制，并阻礙細胞停滯于G2期，誘導其凋亡。任何影響順鉑加合物形成和調節細胞凋亡的因素都可以影響對順鉑的耐藥性。如有報道說，胞內蛋白的失活作用能夠導致細胞對順鉑的耐藥性［5－6］，另外，藥物的攝取和流出異常與順鉑的耐藥性也密切相關，在耐順鉑的細胞株中，通常可以觀察到藥物蓄積降低的現象。某些癌基因與抑癌基因表達的突變與細胞對順鉑的耐藥性有有一定關系，因為這些基因表達的突變可以引起細胞結構與功能的改變［7－11］，促使凋亡機制發生異常，或抑制凋亡通路活性。

通過前期實驗，我們已經證實了TALAS對SKOV3細胞及SKOV3－DDP細胞的抑制作用，但未探討其與順鉑的協同作用［12］。在本實驗中，通過MTT實驗發現，TALAS與順鉑協同應用效果明顯優于單獨使用，證明二者具有明顯的協同作用。而通過Annexin－V FITC/PI雙染法，進一步證實了TALAS誘導耐藥細胞發生凋亡的作用，提示二者的協同作用可能與TALAS的促凋亡作用相關。肺耐藥相關蛋白(lung resistance protein，LRP)被認為是人類的主要穹窿蛋白，分布于胞漿內或核膜上，可通過胞吐機制將藥物排出細胞，從而減少了藥物在細胞內的積聚。其底物非常廣泛，包括鉑類和烷化劑類藥物。通過RT－PCR法檢測TALAS對LRP mRNA水平的表達，結果發現高濃度組TALAS可明顯下調其表達水平。因此，TALAS與順鉑的協同作用可能與其能夠抑制LRP的表達相關。

信號傳導通路的異常也是導致腫瘤細胞耐藥的重要因素，因其網絡性、交叉性，可通過多種直接、間接的渠道影響腫瘤細胞耐藥。NF－κB是一種轉錄因子，包括5個亞型，主要涉及人體防御反應、組織損傷、細胞分化和凋亡及腫瘤生長抑制過程中的信息傳遞。在大多數細胞中，NF－κB可以通過上調促細胞存活基因和凋亡抑制基因的表達，來保護細胞免于凋亡［13］。因NF－κB對維持細胞抵抗腫瘤壞死因子(TNF)的殺傷起著關鍵性作用［14］，而推測NF－κB的抑制凋亡作用可能是通過腫瘤壞死因子受體－1介導的。很多證據顯示，NF－κB與腫瘤多藥耐藥密切相關，并且可能從多方面涉及多藥耐藥性的發生、發展和形成［15－16］，可在各種刺激尤其是化療藥物的作用下高表達，并抵抗化療藥物的促凋亡作用。NF－κB信號傳導通路關鍵蛋白磷酸化水平與其活性密切相關，在本實驗中，通過WB法，發現TALAS可下調其關鍵蛋白磷酸化水平，抑制NF－κB信號傳導通路的活性。因此，推測TALAS與順鉑的協同作用可能與其誘導凋亡及降低耐藥蛋白表達有關，而此作用可能是通過抑制NF－κB信號傳導通路的活性來實現的。

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