PTEN/mTOR信號通路對大鼠神經干細胞分化成熟作用的研究

沈華超， 李文磊， 黃素素， 朱 金， 徐德友， 沈麗華， 丁新生

缺血性腦血管病以其高發病率和高致殘率成為當前嚴重威脅人類健康的一大類重要疾病，但有效的治療方法非常有限。神經干細胞(neural stem cells，NSCs)具有自我更新能力，能夠分化為神經元和膠質細胞。神經干細胞移植可以直接或間接替代已經壞死的神經細胞或組織，重建神經網絡，部分恢復已喪失的功能，被認為是最有潛力的治療腦缺血的方法［1］。然而干細胞移植治療最大的難題是移植的神經干細胞存活、軸突生長及和正常組織建立突觸連接困難。PTEN(phosphatase and tensinhomology deleted on chromosome ten)是近年來新發現的同時具有脂質和蛋白質雙重磷酸酶活性的腫瘤抑制基因，負性調節mTOR通路。研究發現PTEN/mTOR信號通路在神經系統廣泛表達，是神經發生和再生的一個重要的內在控制分子［2～5］。本研究通過體外分離培養大鼠海馬NSCs，觀察其誘導分化過程中PTEN和反映mTOR蛋白活性的P-S6R的表達變化，以期了解PTEN/mTOR信號通路在神經干細胞分化成熟中的作用，探究神經干細胞分化成熟至一定階段后生長及再生能力下降的原因，為促進神經干細胞移植治療提供一定的實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康新生1d的Sprague-Dawley(SD)乳大鼠，體重3～5g(南京醫科大學實驗動物中心提供，常規條件飼養)。

1.2 主要試劑及儀器 DMEM/F12(1∶1)培養基(Gibco);ACCUTASE(Gibco);青鏈霉素(Hyclone);胎牛血清(FBS)(Hyclone);B27(Gibco);堿性成纖維細胞生長因子bFGF(Peprotech);表皮細胞生長因子EGF(Peprotech);兔抗大鼠PTEN多克隆抗體(cell signaling technology);兔抗大鼠P-S6R多克隆抗體(cell signaling technology);兔抗大鼠Nestin多克隆抗體(Santa Cruz Biotechnology);FITC標記羊抗兔IgG二抗、R標記驢抗兔IgG二抗(Santa Cruz Biotechnology)。CO2培養箱(日本三洋公司)，熒光倒置相差顯微鏡(尼康儀器有限公司)，凝膠成像系統(美國UVP公司)。

1.3 大鼠NSCs的分離培養 取新生1d SD乳大鼠，于無菌條件下分離出大腦半球，剔除腦膜，分離出海馬，立即置入預冷的DMEM/F12中，將海馬機械剪碎后用槍頭吹打至單細胞懸液，1000r/min離心5min，棄上清，沉淀物用完全培養基重懸(含有20ng/ml bFGF，20ng/ml EGF，2%B27，1% 雙抗的DMEM/F12)，200目的篩網過濾，血細胞計數器計數后，以5×105cells/ml的濃度接種于25cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO2細胞培養箱培養。24h后換液一次，以后每隔3～4d換液一次。待原代培養的神經球直徑達到200μm左右(大約6～7d)時進行傳代培養，收集神經球，1000r/min離心5min，棄培養基，加入1ml ACCUTASE，37℃消化5min，用槍頭機械吹打神經球為單個細胞，1000r/min離心5min，棄上清，用完全培養基重懸細胞，調整細胞濃度為5×105cells/ml，接種到25cm2培養瓶中，置于37℃、5%CO2細胞培養箱繼續培養。大約6～7d傳代一次，取第3代細胞進行實驗。

1.4 實驗分組及NSCs的誘導分化 收集第三代NSCs，以1000r/min離心5min，棄上清，用誘導分化培養液(含有1%FBS和2%B27的DMEM/F12培養基)重懸細胞，用機械吹打的方法將神經球分散成單個細胞，細胞計數后以5×105cells/ml的濃度接種到PDL包被的培養皿中，隨機分為0d組、1d組、3d組和7d組，置于37℃、5%CO2細胞培養箱中分別誘導分化1d、3d和7d。0d組不做誘導分化處理，直接用于實驗

1.5 免疫熒光檢測 取第3代NSCs接種在內置玻片的6孔板中，待細胞貼壁后，取出玻片，用PBS沖洗3次，每次5min;4%的多聚甲醛室溫原位固定15min，細胞面朝上，PBS洗 3 次，每次 5min;0.3%Triton作用10min，PBS洗3次，每次5min;胎牛血清37℃封閉1h后加入Nestin一抗(1∶200)，放入濕盒內4℃過夜，同時用PBS代替一抗作陰性對照。棄一抗，PBS洗3次，避光環境下加入熒光二抗(1∶200)，37℃孵育1h。PBS洗3次，封片，然后立即在熒光顯微鏡下觀察，攝片。取誘導分化后的神經干細胞，分別用PTEN和P-S6R一抗(稀釋度1∶200和1∶100)檢測PTEN和P-S6R蛋白的表達，具體步驟同上。

1.6 Western blotting檢測 收集各組細胞，加裂解液，冰上裂解30min，4℃超聲破碎，12000r/min離心15min，取上清測定蛋白濃度，-80℃保存待用。調整樣品蛋白濃度一致后以等體積上樣，行10%SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)分離蛋白，濃縮膠和分離膠分別以恒壓100V、150V均電泳lh，分離后的蛋白轉移至硝酸纖維素(nitrocellulose，NC)膜上，用含5%脫脂奶粉封閉1h后，加入PTEN(1∶1000)和P-S6R(1∶2000)一抗，4℃搖床過夜，用TBST緩沖液漂洗10min×3次后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗，室溫搖床孵育1h，TBST緩沖液漂洗10min×3次，采用化學發光法在凝膠成像系統內曝光顯色，以β-actin作為內參，用待檢測蛋白與β-actin灰度值的比值進行比較。

1.7 統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行統計學處理，所得數據用均數±標準差()表示，兩組均數比較采用t檢驗，多組均數間的比較采用單因素方差分析，P﹤0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 NSCs的培養、觀察及鑒定 原代培養的NSCs:剛分離出來的細胞呈圓形，折光性較強，培養2d后可見到單細胞出現分離增殖現象，形成大量的4～5個細胞組成的細胞團，6～7d后可見增殖形成的神經球，大小不一，直徑約200μm左右。收集NSCs機械吹散成單細胞，置于相同條件下繼續培養，可觀察到懸浮的單個細胞分裂、聚集，呈圓球形，大小不一，具有較強的折光性，培養5d后，培養液中可見單細胞增殖再次形成神經球，細胞形態不變。原代和傳代培養的神經球接種到6孔培養板內涂有PDL的蓋玻片上繼續培養4h后進行細胞免疫熒光檢測，經神經干細胞特征性標記神經巢蛋白(Nestin)染色均為陽性(見圖1)。

2.2 NSCs誘導分化過程中神經細胞的形態變化 NSCs接種到培養皿中，未誘導分化時呈球狀懸浮生長，大小不一;誘導分化1d時可見大量神經樣細胞，胞體呈梭性或橢圓形，并伸出突起;隨著NSCs誘導分化時間的延長，神經樣細胞漸趨成熟。誘導分化至7d時神經樣細胞胞體體積增大，細胞形態各異，NSCs初步分化成熟(見圖2)。

2.3 NSCs誘導分化后PTEN和P-S6R的細胞免疫熒光染色 NSCs誘導分化后細胞免疫熒光顯示:PTEN和P-S6R的細胞免疫熒光染色均呈陽性。PTEN在胞漿和胞核中均有表達，而P-S6R主要表達在胞漿中(見圖3)。

2.4 NSCs分化成熟過程中PTEN蛋白的表達變化 在NSCs誘導分化過程中，PTEN的表達隨著分化時間的延長有明顯的增高。與分化0d組相比，3d組和7d組PTEN表達明顯增高(均P﹤0.01);與1d組相比，3d組和7d組PTEN表達亦明顯增高(P﹤0.01和P﹤0.05);與0d組相比，1d組雖有升高，但差異無統計學意義(P＞0.05);與3d組相比，7d組雖有下降，但差異無統計學意義(P＞0.05)。以上結果表明，隨著 NSCs的逐漸分化成熟，PTEN的表達呈明顯增加的趨勢，分化3d時其表達明顯增加，到7d時，仍然高水平表達。隨著NSCs的誘導分化時間的延長，P-S6R的表達呈下降趨勢。與誘導分化0d組相比，3d組和7d組P-S6R表達均明顯下降(均P﹤0.01);與分化1d組相比，3d組和7d組 P-S6R表達亦明顯下降(均 P﹤0.01);與0d組相比，1d組雖有下降趨勢，但差異無統計學意義(P＞0.05);與3d組相比，7d組雖有增高，但差異無統計學意義(P＞0.05)。以上表明隨著NSCs的逐漸分化成熟，P-S6R的表達呈明顯下降的趨勢，分化至3d時，P-S6R明顯降低，當分化至7d時，表達水平仍然較低。

圖1 免疫熒光染色鑒定NSCs(400×)

圖2 NSCs誘導分化后的細胞形態特征(200×)

圖3 NSCs誘導分化后PTEN和P-S6R細胞熒光染色(200×)

3 討論

NSCs是一類具有高度自我更新能力并能分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞的神經前體細胞，廣泛分布于發育和成年哺乳動物中樞神經系統中，研究證實這類細胞可以在體外分離培養并長期傳代克隆，原代和傳代培養的NSCs在適宜的條件下具有多向分化的潛能，這就為缺血性腦血管病提供了一種潛在的治療方法，即外源性NSCs的移植治療。然而腦缺血后移植的NSCs分化成熟至一定階段后軸突內在生長能力和再生能力下降，使得腦缺血后神經功能的恢復有限。PTEN作為一種腫瘤抑制基因被發現在神經系統的表達也較為廣泛，Perandones等［6］在鼠的大腦皮質、小腦、海馬及嗅球等部位的神經元發現均有PTEN表達。本研究發現NSCs誘導分化后PTEN和P-S6R細胞免疫熒光染色為陽性，證實了NSCs分化成熟過程中PTEN和P-S6R均有表達，其中PTEN在胞漿和胞核中均有表達，而P-S6R主要表達在胞漿中。PTEN主要通過其脂質磷酸酶活性作用于下游PI3K的下游靶分子PIP3，從而使PIP3脫磷酸化生成PIP2阻斷AKT 及其下游激酶的活性［7，8］。PI3K/Akt/mTOR信號通路是參與細胞增殖﹑分化﹑凋亡和代謝的重要信號通路，mTOR是PI3K/Akt信號通路下游的一個效應分子，mTOR激活后，可激活下游靶蛋白PS6R。P-S6R活化后促進核糖體蛋白和翻譯調節蛋白的合成，從而對蛋白合成進行調節。已經證實，Akt/mTOR/P-S6R通路可通過調節cap-依賴性蛋白翻譯的起始來調控蛋白質合成，控制細胞的生長和大小，支持細胞的生長和存活［9］。因此，PTEN可通過負性調節P-S6R的活性，抑制相關蛋白的生成和細胞的生長，從而限制細胞和組織的過度增殖。本研究顯示，與分化0d和1d相比，NSCs分化至第3天時，PTEN表達明顯增高(均P﹤0.01)，而P-S6R明顯下降(均P﹤0.01);分化至第7天時，PTEN的表達仍然較高(P﹤0.01和P﹤0.05)，P-S6R表達較低(均P﹤0.01)。這說明NSCs分化成熟過程中PTEN表達逐漸增高，而P-S6R的表達逐漸下降。據此，我們推測在 NSCs分化成熟過程中PTEN/mTOR信號通路很可能是通過PTEN抑制mTOR的活性，下調了P-S6R的表達，從而參與抑制NSCs分化成熟后細胞增殖和軸突的生長能力。類似的研究發現PTEN在未分化的神經元和PC12細胞中表達很低，而在用神經營養素誘導分化后的神經元內表達上調［10］。

PTEN在體內神經系統發育成熟過程中也有相似的改變。Lachyankar等［11］研究發現，PTEN在小鼠腦發育晚期約在出生0d開始表達，成年時達高峰。在神經元的發育過程中，樹突中的PTEN的表達進行性增加，成年時到達高峰，從而下調蛋白合成，限制樹突的生長和突觸的可塑性。這些研究結果提示在中樞神經系統發育成熟過程中PI3K/Akt/mTOR一方面促進神經細胞的增殖分化成熟;另一方面又通過上調PTEN抑制PI3K/AKT/mTOR通路，從而抑制神經細胞及其軸突的過度分化生長，動態地調節神經系統的平衡，維持神經系統的正常生理功能。然而成熟神經系統PTEN的高表達抑制了神經細胞及其軸突的生長能力，不利于腦卒中后缺血灶周圍神經的再生修復，從而影響患者的功能恢復。已有研究發現PTEN基因敲除的成年小鼠，室管膜下區的內源性神經干細胞具有明顯增強的持續增殖能力及向神經元分化的能力［12，13］。

總之，本研究提示PTEN/mTOR信號通路是調控NSCs增殖分化成熟的重要分子機制，PTEN/mTOR的時空表達變化控制著NSCs的增殖分化和軸突生長能力。NSCs分化成熟過程中PTEN表達增高可能是導致神經干細胞分化成熟至一定階段后增殖分化能力和軸突生長、再生能力下降、不能建立有效的突觸聯系的重要原因。本研究結果為提高神經干細胞移植治療的效率提供了新思路，對探索腦缺血的有效治療途徑有重要意義。進一步的研究可在體外進行神經干細胞PTEN抑制實驗，以觀察NSCs的增殖分化能力和軸突生長、再生能力，再進行神經干細胞移植治療腦缺血，以期能夠更明顯地促進腦缺血后的功能恢復。

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