載脂蛋白AV水平及-1131T＞C基因多態性與腦梗死

許 綪， 肖志杰， 朱元凱

載脂蛋白AV(apolipoprotein AV，apoAV)基因是由兩個課題組在2001年通過不同的方法［1，2］在人類染色體IIq23的載脂蛋白基因簇(APOA 1/C3/A4)內同時發現的。ApoAV分子及其基因多態性在體內血脂代謝，特別是甘油三酯(triglyceride，TG)的代謝過程中起著關鍵作用［3，4］。并有多項研究［5，6］認為血清apoAV水平及其基因變異與代謝綜合征明顯相關。ApoAV可能與C反應蛋白(Creactive protein，CRP)相似，是一種潛在的炎癥因子和急性期反應蛋白(acutephase reactive protein，ARP)［7］。

隨著我國人口的老齡化，腦梗死的發病率呈逐年上升的趨勢，給社會、家庭帶來了沉重的負擔。其中腦血栓形成是腦梗死最常見的類型，約占全部腦梗死的60%以上，其主要病理基礎是動脈粥樣硬化。動脈粥樣硬化的主要病理機制是血脂代謝異常［8］和炎癥反應［9，10］。ApoAV 對血脂代謝和炎癥反應均有影響，因此認為apoAV可能具有血管保護作用，減少動脈粥樣硬化相關血管病變(如冠心病、腦卒中等)發生和發展的重要意義。

自從2001年發現apoAV并證實其參與血脂代謝的調節以來，已對 apoAV基因多態性與血脂［11，12］、代謝綜合征［5，6］和冠心病［13，14］的關系進行了大量的研究，而對于apoAV-1131 T＞C基因多態性與腦梗死之間關系的研究目前還很少。我們通過病例一對照研究比較血清apoAV水平及其與TG的關系在腦梗死患者和正常人群之間的差異，并動態觀察腦梗死急性期血清apoAV水平的變化。觀察apoAV-1131 T＞C基因多態性在腦梗死患者及正常對照人群中的分布差異，并探討apoAV-1131 T＞C基因多態性與血清apoAV水平、TG水平及腦梗死之間的關系。

1 材料與方法

1.1 研究對象

1.1.1 病例組 急性期腦梗死患者組研究對象來自湘雅二醫院急診科及神經內科住院患者，均符合“第四屆腦血管病會議的腦血管疾病診斷要點”［17］所確定的缺血性腦卒中的診斷標準，并經頭部CT和/或MRI證實，病程均小于1d。共入選123例，男性67例，女性56例，平均年齡 61.6±10.8歲。病例組患者，在入院時均應用美國國立衛生院卒中量表(NIHSS)進行神經功能評分，并采用TOAST分型標準對腦梗死患者進行分型。

1.1.2 對照組 正常對照組為同期湘雅二醫院常規體檢者。納入標準:與病例對照組進行年齡、性別匹配，經詢問病史，大部分經過CT和/或MRI證實無腦卒中。共入選113例，男性54例，女性59例，平均年齡63.4±11.8歲。兩組均常規心電圖，胸片檢查，必要時行頸部血管彩超和心臟彩超檢查。

1.2 研究方法

1.2.1 血生化指標測定

入院后第2天清晨空腹采集外周靜脈血，血清TC和TG采用酶法測定，HDL-C和LDL-C采用化學遮蔽法直接測定，同時檢測空腹血糖(fasting plasma glucose，FPG)、尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(carnine，Cr)和丙氨酸轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)。

1.2.2 血清apoAV水平測定 清晨空腹采集外周靜脈血，血清apoAV水平采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法，共選取腦梗死急性期(2w內)4 個時間點:24h內、3d、7d及14d。

1.2.3 氯仿法抽提外周血白細胞基因組DNA。

1.2.4 多聚酶鏈式反應-限制性片段長度多態性測定檢測apoAV-1131 T＞C基因。

1.3 DNA測序 將apoAV-113T1＞C的TT基因型和CC基因型PCR擴增產物進行DNA序列測定，由測序圖譜可以看出，TT基因型中的堿基T突變為CC基因型中的C，這與酶切的結果一致，也與文獻報道相符［1］。

1.4 統計分析 應用SPSS 13.0軟件包進行統計分析。計量統計指標均進行正態性檢驗，計量資料兩組間的比較采用獨立樣本t檢驗，兩組以上采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，組間比較采用LSD法。各組間計數資料、基因型和等位基因頻率分布比較采用χ2檢驗。非正態分布的變量間相關性分析采用Spearman等級相關分析。采用Logistic回歸單變量分析，篩選出腦梗死的主要危險因素，選擇逐步Logistic回歸方法(Forward，LR法)篩選出獨立危險因素，計算出比值比(odds ratio，OR)及95%可信區間(confidence intervals，CI)。以雙側P＜0.05為具有統計學顯著性差異。

2 結果

2.1 腦梗死組與對照組在年齡和性別構成上無顯著差異(P＞0.05)，兩組之間具有可比性。肝功能指標(ALT)、腎功能指標(BUN及Cr)和血脂指標中TC和LDL-C、apoAV水平在病例組與對照組間無明顯差異(P＞0.05)。而病例組TG及FPG水平較對照組明顯升高(P＜0.05及 P＜0.01)，HDL-C水平較對照組明顯降低(P＜0.01)。

2.2 血清apoAV水平與TG等生化指標的關系 分析顯示血清apoAV水平與TG水平呈負相關(rs=-0.132，P ＜0.05)，相關關系并不密切。血清apoAV 水平與 TC、HDL-C、LDL-C、FPG、BMI及血壓水平間無相關關系(P＞0.05)。分組后發現血清apoAV水平與TG水平的負相關關系在對照組中更加顯著(rs=-0.212，P ＜0.05)，而在病例組中兩者無相關關系(P＞0.05)。病例組中血清apoAV水平與腦梗死NIHSS評分間有呈正相關的趨勢，但無統計學意義(rs=0.161，P ＞0.05)。

2.3 腦梗死急性期血清apoAV水平變化趨勢對病例組腦梗死急性期2w內4個時間點(24h內、3d、7d及14d)進行血清apoAV水平檢測，發現在第3天時血清apoAV水平達到高峰，3d及14d內有下降趨勢(由各時間點的apoAV濃度平均值±標準差表示)，但通過配對t檢驗分別對血清apoAV水平在4個時問點間進行兩兩比較，各時間點間差異無顯著性(均P＞0.05)。

2.4 病例組與對照組apOAV 1131 T＞C基因型分布的比較 在研究總人群中apoAV-1131 T＞C基因型的頻率分布為:TT 41.9%、TC 41.9%、CC 16.1%。等位基因 T、C的頻率分別為62.9%和37.1%(見表1)。在對照組和病例組中基因型均以TT型多見，TC型次之，而CC型較少見，其等位基因頻率分布均以T等位基因為常見等位基因，C等位基因為少見等位基因。按Hardy-weinberg平衡定律對研究總人群進行了平衡檢驗，χ2=2.405，df=1，P＞0.05，說明我們選擇的研究總人群基因頻率能夠代表群體的基因分布。對組間apoAV-1131 T＞C 3種基因型及等位基因分布比較進行卡方檢驗，兩組間有顯著性差異(P＜0.05)，病例組TC及CC基因型頻率較對照組更高。

進一步比較C等位基因攜帶者(TC+CC)與TT純合子基因型攜帶者在兩組間的分布，差異更具有顯著性(P ＜0.01)，結果(見表2)，apoAV 1131T ＞C基因型在TOAST分型各亞型間的分布無明顯差異(P ＞0.05)，結果(見表3)。

2.5 ApoAV-1131 T＞C基因型與血清apoAV、TG等生化指標的關系 ApoAV-1131 C等位基因攜帶者TG水平較TT基因型明顯升高(P＜0.05)，apoAV及其它血脂指標(TC、HDL-C及 LDL-C)水平，在兩組間無明顯差異(均P＞0.05)。進一步分別對病例組及對照組中apoAV-1131 T＞C各基因型間apoAV水平的差異進行分析，均未發現apoAV-1131 T＞C基因多態性與apoAV水平相關(均P＞0.05)(見表4、表5)。

2.6 腦梗死危險因素的多因素分析 采用logistic回歸單變量分析，篩選出腦梗死的主要危險因素，進一步選擇逐步logistic回歸方法(Forward，LR法)篩選出獨立危險因素。經單變量logistic回歸選出的候選變量有:高壓病史、糖尿病史、高血脂癥史、心臟病史、吸煙史、卒中家族史、FPG、SBP、DBP、BMI、TG、HDL-C及apoAV-1131 C等位基因。然后將所有候選變量引入多因素logistic回歸模型，得出腦梗死主要危險因素有高血壓病史、apoAV-1131 C等位基因及FPG，而HDL-C具有保護作用。其中apoAV-1131 C 等位基因 OR=1.897，95%CI 1.029～3.499，P ＜0.05)，結果(見表 6)。

表1 病例組與對照組apoAV-1131 T＞C基因型分布的比較

表2 病例組與對照組apoAV-1131C等位基因攜帶者分布的比較

表3 apoAV-1131 T＞C基因型在TOAST各亞型間的分布

表4 apoAV-1131 T＞C基因型與血清TG等指標關系

表5 apoAV-1131 T＞C基因型與血清apoAV水平的關系

表6 腦梗死主要危險因素的多因素Logistic回歸分析結果

3 討論

3.1 血清apoAV水平與TG代謝 ApoAV蛋白分子與其他載脂蛋白的氨基酸序列相似，這提示apoAV 同樣具有血脂運輸功能［1］。Penneacchio等［1］實驗發現與對照組相比，表達人apoAV的轉基因小鼠血漿TG水平下降66%，而敲除apoAV基因的小鼠TG水平升高了4倍。但是這兩種小鼠模型的TC和HDL-C的水平與對照組相比均沒有明顯差異。隨后Vliet等［3］培育出過度表達鼠apoAV基因的小鼠。這種轉基因小鼠血漿中的apoAV水平升高了近20倍，而血漿TG和TC濃度分別降低了70%和40%，其中HDL-C在膽固醇變化中降低幅度最大，從而導致血漿TC濃度降低。以上的動物試驗表明apoAV對血漿TG水平有負性調節作用。

流行病學研究也得出了相似的結論。Ishihara等［15］通過ELISA技術對196名健康受試者和106名2型糖尿病患者血漿apoAV水平與血脂代謝之間的關系進行了研究。正常組中女性apoAV水平較男性更高。血漿apoAV水平與HDL-C呈正相關(r=0.32，P ＜0.0001)，而與血漿 TG 水平呈負相關(r=-0.22，P=0.021)。另一項研究［16］也表明血清apoAV水平與TG水平呈負相關，并且在女性人群更顯著(r=0.496，P=0.001)。本研究亦發現湖南漢族人群中血清apoAV水平與TG水平呈負相關(rs=-0.132，P=0.046)，在正常人群中其相關性較研究總人群更顯著(rs=0.212，P=0.024)。

但在另一項對2490個受試者的15年隨訪研究［17，18］則認為，不論是糖尿病患者或是正常人群中血漿apoAV水平均與TG水平呈正相關。ApoAV在TG代謝中起著關鍵作用，但TG水平尚受到其它因素的影響，如飲食結構、載脂蛋白CIII(apolipoprotein CIII，apoCIII)和脂蛋白酯酶(lipoprotein lipase，LPL)等。ApoAV調節TG代謝的作用機制尚未完全闡明，目前認為apoAV主要通過以下3個途徑影響代謝:(1)阻礙肝臟中VLDL的裝配，引起VLDL分泌減少［19］;(2)LPL是 TG代謝中的關鍵酶，apoAV可能作為LPL的激活劑促進TG分解［20］;(3)促進肝臟攝取脂質顆粒，增強VLDL與低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor，LDL-R)的親和力［4，21］。

3.2 ApoAV與炎癥、急性期反應 近來有研究認為在某些情況下，如機體存在急慢性炎癥狀態時apoAV可能并非起調節TG代謝的作用。Khovidhunkit［7］等發現經腹腔注射內毒素后，小鼠血漿中HDL中的apoAV和apoAIV水平升高，肝臟中apoAV基因mRNA表達水平亦增加，8h可達2～3倍，24h內持續升高，認為apoAV可能是一種正性ARP，在APR中并非起到調節脂質代謝的作用。但在Becker等［22］的研究中卻發現人及小鼠在 APR時血漿apoAV和TG水平均是下降的(P＜0.01)。通過對HepG2腫瘤細胞進行腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白介素-1β(intelleukin 1β，IL-1β)的干預，apoAVmRNA表達分別下降為42%和55%(均 P＜0.001)。他們認為這是由于 apoAVmRNA穩定性的改變而導致apoAV基因表達減少。雖然這兩個試驗對APR中apoAV水平變化的結果并不一致，但都認為apoAV并不像在其它研究中觀察到的那樣與TG水平呈負相關，提示此時apoAV可能并非作為TG調節因子而起作用。這也說明了APR狀態下apoAV作用的復雜性，目前急慢性炎癥狀態下apoAV作用及機制的相關研究并不多，對于其生理學及病理生理學作用仍需進一步的深入研究。

對于腦梗死急性期apoAV與TG水平相關關系的研究國內外尚未見報道。本研究對腦梗死急性期及正常人群分別分析，發現血清中兩者的關系在兩個人群中有明顯差異。血清apoAV水平與TG水平在腦梗死組無關(rs=0.036，P=0.703)，而在正常人群中呈負相關(rs=-0.212，P=0.024)。腦梗死急性期(2w)內血清apoAV水平有非顯著性動態變化，雖然各時間點間血清apoAV水平的差異無統計學意義，但有在3d時達到高峰，7～14d逐漸下降的趨勢。此點與腦梗死急性期病情發展、變化的趨勢基本一致。腦梗死急性期，apoAV可能作為一種急性期反應蛋白起作用，而與TG代謝無關。仍需要進一步更加嚴謹、更大樣本量的研究明確apoAV在腦梗死急性期中的角色。

3.3 血清apoAV、TG水平與腦梗死 動脈粥樣硬化的主要病理機制是血脂代謝異常［8］和炎癥反應［9，10］。而ApoAV在TG代謝中起著重要的調節作用，并且可能與CRP相似，是潛在的一種急性期反應蛋白和炎癥因子。因此可以推測apoAV可能具有血管保護作用，能夠減少動脈粥樣硬化及其相關血管病變(冠心病、腦卒中等)的發生和發展。此點己通過動物實驗得到證實［2，23］，載脂蛋白 E基因敲除小鼠將引起血脂代謝障礙，通過轉基因技術使其表達人apoAV分子。發現人apoAV的表達可以顯著降低此種動物模型中血漿TG水平，并且能夠延緩動脈粥樣硬化病變的發生和發展。進一步對這種基因缺陷小鼠進行過氧化物酶體增生物激活受體-α(peroxisome proliferator-activated receptor-α，PPAR-α)受體激動劑的干預，能進一步加強其血管保護作用。遺憾的是目前尚未見報道對血漿/血清apoAV水平與腦梗死之間的關系進行研究。

本研究為病例對照研究，病例組與對照組間血清apoAV水平無明顯差異。對腦梗死患者進行TOAST分型，各亞型間血清apoAV水平亦未見明顯差異。對于血清apoAV水平與腦梗死NIHSS評分相關性分析顯示兩者雖有正相關的趨勢，但無統計學意義(rs=0.161，P=0.108)。ApoAV 作用的復雜性及腦梗死病因和分型的復雜性可能影響apoAV與腦梗死之間關系的分析。另一方面，apoAV與腦梗死關系的不明確也可能與TG代謝和腦梗死的關系尚未完全明確有關［24～29］。Labreuche 等［24］認為 TG水平與腦卒中發病呈正相關，支持通過降低血漿TG水平預防腦卒中。最近一項大型前瞻性研究［25］認為餐后TG水平與缺血性腦卒中發病呈正相關，在男女人群中均發現隨著TG水平的升高，多因素校正后的缺血性腦卒中發病風險逐漸增加(P＜0.001)。此項研究較以往不同，檢測的是餐后TG水平，并且采用了更合理的統計學方法。但北美［26］及歐洲［27］的腦卒中防治指南均未將血漿TG水平升高列為腦卒中的危險因素。英國的一項研究［28］發現低水平的TG可能引起腦卒中死亡率增高。對于腦卒中的預后，血漿TG水平的相對危險度(relative risk，RR)=0.84，95%CI=0.77 ～0.91。Dziedzic 等［29］的另一項研究也得出了相似的結論。本研究中發現腦梗死患者血清TG水平較正常人群明顯升高，并有統計學差異(P=0.022)，血清TG水平升高將增加腦梗死的患病風險。

3.4 ApoAV-1131 T＞C基因多態性與血清apoAV，TG水平 英國的一項研究［18］表明 apoAV-1131C等位基因攜帶者血漿TG水平更高，而apoAV水平與-1131 T＞C基因多態性無關。認為apoAV 1131 T＞C基因多態性可能與apoCIII基因變異之間存在連鎖不平衡，而非直接通過周圍循環中apoAV水平的改變而影響TG代謝。Henneman等［30］發現血清apoAV水平與apoAV S19W基因變異相關，而與apoAV-1131 T＞C基因多態性無關。同樣發現-1131C等位基因攜帶者血漿TG水平更高。本研究發現-1131C等位基因攜帶者血清apoAV水平較TT純合子人群為低，但無統計學差異(P=0.240)，分別對兩組分析均未見有顯著性差異。-1131C等位基因攜帶者血清 TG水平更高(P=0.017)。提示apoAV-1131 T＞C基因多態性不通過改變血清apoAV水平而引起TG水平的變化。可能機制為:(1)ApoAV 1131T＞C基因多態與apoCIII基因位點存在連鎖不平衡，間接通過apoCIII水平的改變調節TG代謝。(2)肝細胞內apoAV基因的表達相對其它載脂蛋白并不少，只是分泌入血的量極少從而導致其血清中apoAV的水平極低。肝細胞內apoAV同樣具有調節脂質代謝的作用，包括細胞內的脂質儲存及動員。ApoAV-1131 T＞C基因多態可能影響肝細胞內apoAV的濃度而影響細胞內TG代謝，進一步引起血清TG水平的改變。(3)美國弗明漢心臟研究［31］發現apoAV-1131 T＞C基因多態可能與飲食習慣結構有關，apoAV-1131 C等位基因攜帶者脂肪攝入量更高(P=0.047)，從而進一步引起TG水平的升高。

3.5 ApoAV-1131 T＞C基因多態性與腦梗死美國弗明漢子代研究［32］對2273名受試者apoAV的5個基因多態位點(-1131 T＞C、-3A＞G、56C＞G、IVS3+4766＞A和1259T＞C)進行了分析。其中56C＞G多態位點的G等位基因與頸動脈內膜厚度呈正相關(P＜0.05)。在肥胖患者中經過對TG的校正，-1131 T＞C等另4個位點的變異型等位基因與頸動脈內膜厚度也呈顯著相關(P＜0.05)。目前對于apoAV-1131 T＞C基因多態性與腦梗死之間關系的研究還很少，但都得出了腦梗死發病與apoAV-1131 T ＞ C 基因多態性有關的結論［33，34］，并可能是通過TG水平的升高引起;另一方面腦梗死是一種多基因遺傳疾病，不遵循孟德爾遺傳法則［35］，單基因位點變異并不能引起腦梗死的發病。ApoAV-1131 T＞C基因多態位點可能與其它腦梗死相關基因位點存在連鎖不平衡，并與環境因素相互作用而增加腦梗死的易感性。仍需要進一步大規模的研究明確它們之間的關系，為腦梗死的早期診斷和預防提供新的依據。

4 結論

(1)在湖南漢族非腦梗死人群中，血清apoAV具有降低血清甘油三酯水平的作用，在急性腦梗死患者中血清apoAV與甘油三酯水平無關;(2)血清apoAV水平在急性腦梗死患者與正常人群之間無明顯差異，在腦梗死急性期無顯著性動態變化;(3)ApoAV-1131 C等位基因與甘油三酯水平升高有關，但與apoAV水平無關;(4)ApoAV-1131 C等位基因是腦梗死的獨立危險因素。

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