4種魚肉羥脯氨酸含量的測定

2013-08-11 07:12:28張延華馬國紅王愛英王秉利山東省淡水水產研究所山東濟南250117

長江大學學報(自科版) 2013年29期

張延華，馬國紅，王愛英，王秉利，許鵬（山東省淡水水產研究所，山東濟南250117）

膠原蛋白又稱膠原，是動物體內結締組織的重要組成成分，約占其體內總蛋白質含量的1／4［1］。膠原蛋白含有豐富的甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸及羥脯氨酸。羥脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）是膠原蛋白的特征性氨基酸，通過測定羥脯氨酸的含量，然后乘以相應的系數就可以得到膠原蛋白的含量。羥脯氨酸的測定包括比色法、氨基酸分析儀法和HPLC法、電泳法等，以比色法最為常用［2］。

提取膠原蛋白的傳統原料主要是陸生哺乳動物，如豬、牛的皮和骨。由于近年來哺乳動物疫病的爆發和人畜共患病的增加，世界各國都在積極尋找新的膠原蛋白來源，同時漁業養殖的大規模發展使水產膠原蛋白替代哺乳動物成為可能。不少學者對魚類組織中的羥脯氨酸進行測定，以為尋找新的膠原蛋白原料提供理論依據。張俊杰等［3］曾用比色法測定魚鱗中羥脯氨酸，胡建平［4］對魚骨中的羥脯氨酸進行過測定，魚皮中的羥脯氨酸含量也有過報道，但魚肉中羥脯氨酸的含量卻鮮有報道。本研究選取草魚（Ctencpharyngodon idellus）、鯉魚（Cyprinus carpio）、鳙魚（Aristichthys mobilis）、羅非魚（Oreochromis mossambicus）作為研究對象，對其魚肉中的羥脯氨酸含量用比色法進行測定，以期為魚肉的綜合開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

草魚、鯉魚、鳙魚、羅非魚均購自濟南市某水產品市場，魚體健康無病，體重1kg左右，冰塊保存運至實驗室，每尾魚分別取背部的肌肉。由于受生長環境、營養條件、魚體大小等因素的影響，魚體不同部位肌肉所測得的結果會有差異。就同種魚類來說，魚體背部肌肉的營養成分相對比較穩定。為了便于取樣與比較，本研究中的采樣統一取背部肌肉即自魚體兩側鰓蓋骨后至尾鰭前取體背部肌肉作為樣品進行測定。用刀將魚肉在冷凍時（0℃以下）切成小塊（約0.5cm3，邊長約為8mm），置于－20℃冰箱保存備用。其中一部分用于常規營養成分測定，一部分用于羥脯氨酸的測定。

1.2 常規營養成分測定

水分含量測定采用105℃烘干失水法［5］，粗蛋白含量測定采用微量凱式定氮儀法［6］，粗脂肪含量測定采用索氏抽提法［7］，灰分含量測定采用550℃干法灰化法［8］。

1.3 羥脯氨酸含量的測定

4種魚肌肉樣品的羥脯氨酸含量測定方法參照GB／T 9695.23－2008／ISO 3496：1994［9］略作修改。

1.3.1 標準曲線制作

按文獻［9］的方法分別制得濃度依次為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0μg／ml的標準工作液。再分別移取4.00ml羥脯氨酸標準工作液于比色管中，加入2.00ml氯胺試劑，混合后于室溫下放置（20±1）min。加入2.00ml顯色劑于比色管中，充分混合，用塑料薄膜將比色管封口，迅速放入60℃水浴中，保溫20min。取出比色管，用流動水冷卻比色管至少3min，在室溫下放置30min。用水作參比，于（558±2）nm處用分光光度計測定光密度值。以扣除了空白的標準工作液的光密度為縱坐標，以相應的濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

1.3.2 測定步驟

將切好的試樣裝入耐熱塑料袋中，70℃以上保溫30min后，冷卻。用絞肉機將試樣均質。稱取4g試樣（精確至0.001g）于燒瓶中，避免試樣粘在燒瓶壁上。量取（30±1）ml硫酸溶液，加入燒瓶中，用表面皿蓋住，于105℃干燥箱內恒溫16h。用圓形濾紙趁熱將水解產物過濾至250ml容量瓶中。用10ml硫酸溶液分3次洗滌燒瓶和濾紙，合并至上述容量瓶中。用水定容，搖勻。

用移液管移取一定體積（V）的水解產物至250ml容量瓶中，定容后羥脯氨酸的濃度在0.5～2μg／ml之間。移取4.00ml上述溶液于比色管中，加入2.00ml氯胺試劑，混合后于室溫下放置（20±1）min。按1.3.1所述步驟與方法，用水作參比，于（558±2）nm處用分光光度計測定光密度值。

1.3.3 羥脯氨酸含量計算

扣除空白溶液的吸收，從所得標準曲線查得水解產物中羥脯氨酸的含量。試樣中羥脯氨酸的含量按下式計算：

式中：X為試樣中羥脯氨酸的含量，%；c為由標準曲線得到的試樣溶液中羥脯氨酸的濃度，μg／ml；m為試樣質量，g；V為從250ml容量瓶中吸取濾液的體積，ml。

2 結果與分析

2.1 常規營養成分含量

4種魚肌肉基本營養成分測定結果見表1。由表1可以看出，4種魚肌肉中都含有大量的水分，其中鳙魚、羅非魚都在80g／100g以上；草魚、鯉魚、鳙魚、羅非魚4種魚肌肉中干物質分別占 21.23%、25.68%、18.58% 和19.13%，這些干物質中大部分為蛋白質，其蛋白質含量分別占4種魚肌肉干物質總量的76.22%、66.48%、83.66%和85.43%，其大小順序為羅非魚＞鳙魚＞草魚＞鯉魚。因此，僅從蛋白質含量來說，魚肉是一種優良的蛋白質來源。4種魚肉中鯉魚的脂肪含量最高，草魚次之，鳙魚、羅非魚最低。4種魚灰分含量相差不大。