流式細胞分選術的應用進展

黃瑩瑩

（浙江大學 醫學部公共平臺，浙江 杭州 310058）

流式細胞術(flow cytometry，FCM)是一項新型的、發展迅速的生物醫學分析技術，它不僅可以對細胞、微生物等進行檢測分析，而且還可以根據顆粒特性進行分選，具有檢測速度快、測量指標多、采集數據量大等特點，因而被廣泛應用于免疫學、細胞生物學、腫瘤學、血液學、藥物開發、環境檢測、食品衛生防疫等科學研究和工作中[1]。

1 流式細胞術的概念

流式細胞術是20世紀60年代末開始發展起來的技術，它是集激光技術、光電測量技術、電子生物技術、電子計算機技術、流體力學以及熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的新型高科技細胞分析技術。流式細胞儀是應用流式細胞術的有效工具，它使細胞或微粒在鞘液包裹下流動，逐個通過激光聚焦區，并用高靈敏度的光學系統收集各散射光及熒光信號，再經過計算機系統對采集的信號進行存儲、顯示，從而得以對粒子進行多參數分析，包括諸如粒子顆粒度和大小、細胞周期、細胞內細胞因子、細菌表面抗原、多分子復合體排列、多價反應動力學等[2]。分選型流式細胞儀一般還有篩分的作用，可以根據所檢測顆粒的某種性質進行分選和回收，用于后續功能實驗。并且，如果整個分選的過程是在無菌條件下進行的，分選下來的細胞還可以用來繼續培養。在我國，20世紀90年代初已開始研發應用流式無菌分選的技術[3]。

2 流式細胞分選的原理

分選型流式細胞儀一般由液流系統、光路系統、檢測分析系統和分選系統4部分組成。流式的分選功能是通過鞘液流形成含有細胞的帶電液滴而實現的。在流動室的噴嘴上裝有一個高速振蕩器，該裝置在充電后以每秒幾萬次的振動頻率，使鞘液流成為上萬個液滴；目前，先進的分選型流式細胞儀震蕩速度可以達到10萬/s。此時，細胞的熒光和散射光信號已被測量（即判斷液滴是否該被分選），這時給鞘液流一個充電脈沖信號，待分選的液滴就全部帶上了電荷。流式細胞分選儀的檢測分析系統通過分選設門特性迅速判定其是否為靶細胞。當充以不同電荷的含細胞的鞘液滴流經帶有正負幾千伏恒定靜電電場的偏轉板時，就根據自身所帶的電荷性質產生偏轉而落入各自的收集管中，不帶電荷的液滴就進入廢液槽中，從而實現了細胞的流式分選[4]。

現代高端型流式細胞分選儀每秒可以實時檢測定量分析、分選數萬個細胞，儀器可選配3-9根激光管，最多可檢測l8個熒光參數，從而滿足日益多元化的、深入的前沿科學研究的需要[1]。

3 流式細胞分選術的應用

3.1 利用流式細胞分選術分選腫瘤干細胞

腫瘤干細胞是腫瘤中具有自我更新、無限增殖及多向分化潛能的細胞，這部分細胞雖然只占少部分，但在腫瘤的發生、演進、復發、耐藥及逃逸免疫系統的識別和清除過程中可能發揮了至關重要的作用[5]。因此，建立有效的腫瘤干細胞分離方法，將有助于人們深入了解腫瘤的發病機理，從而建立新的有效的治療方法。例如，王玲燕等（2012）[5]采用流式細胞分選術從人乳腺癌細胞系MCF-7中分選CD44+CD24-/low乳腺癌干細胞，進行了干細胞比例分析，并用免疫熒光法檢測、比較分選獲得的細胞和對照細胞的干性和分化標記物的表達狀態。結果表明分選獲得的CD44+CD24-/low乳腺癌于細胞陽性比例達90%以上，即CD44+CD24-/low表面標記物分選的方法可以富集高純度的乳腺癌干細胞。Yang等[6]通過流式分選從肝癌組織中分離出了CD45-CD90+細胞，研究表明CD45-CD90+可以用來作為人類肝癌的一個標志物，亦能成為診斷和治療該惡性腫瘤的重要靶點。近期，Hassan等[7]又通過流式分選得到了具有類似肺癌干細胞的細胞群，通過對其功能進行研究，可為肺癌的治療提供有力的參考依據。

3.2 利用流式細胞分選術分選外周血細胞

傳統的從外周血分離單核細胞的方法一般需要反復離心清洗，會造成大量細胞損失，如需獲取純度較高的單核細胞，則需要進一步利用抗體、磁珠等技術加以純化，實驗成本較高，且獲得的單核細胞容易被激活而給實驗結果帶來影響。基于流式細胞儀的分選功能，根據細胞的大小以及顆粒度等特征，對白細胞直接進行分選獲取人外周血中的單核細胞的方法，既避免了多次重復離心，又能分選得到純度在80%-90%之間的單核細胞用于后續實驗，為深入研究單核細胞提供了良好的技術平臺[8]。此外，李璐等應用流式細胞分選儀分離中性粒細胞，陽性細胞收集率和純度均非常高，試驗證實可達99%，且分離時間較短；該方法特別適合含量稀少、比較珍貴細胞的分離[9]。本實驗室的流式細胞分選儀曾根據課題組[10]的研究需要，從脾臟或胸腺中分選目的T細胞細胞亞群，分選純度達98%以上，分選活性好，為后續工作的開展提供了高純度高質量的細胞。

3.3 利用流式細胞分選術分選染色體

由于基因組太大或重復DNA和多倍體的存在造成的序列冗余，許多植物物種的基因組分析經常比較困難。Vrána等[11]通過流式分選的方法得到了高質量的單個染色體，該方法可同時純化大量染色體，為后續試驗，如植物基因組測序等提供了方便。

3.4 利用流式細胞分選術分選造血干細胞

造血干細胞(hematopoietic stem cell，HSC)為血液系統最原始的細胞，具有自我更新、自我維持并向多系分化與增殖的能力，在整個造血細胞群體中僅占很小比例，一直是成體干細胞研究中的熱點。徐勇等[12]聯合應用免疫磁珠分離和流式細胞分選術，可以較高的回收率快速純化高純度的早期造血干細胞亞群。李喬等[13]通過配制HSCs體外培養液并結合流式細胞分選技術，建立了一種在體外不需要基質細胞支持的，穩定的，高通量培養單個HSC形成一個血細胞集落的實驗方法。

3.5 利用流式細胞分選術分選神經細胞

在體模型中星形膠質細胞和神經元這些組織結合非常緊密，過去由于研究技術的局限，分開它們的方法很困難，因此研究分離神經細胞的方法即成為近年來國內外相關研究的熱點。如王萍等[14]通過反復實踐摸索建立了一種較為完善的流式細胞儀分選在體模型中神經細胞的技術方法，該分選方法可以同時獲得純度高、數量多的不同種類的神經細胞。

3.6 利用流式細胞分選術建立穩定細胞轉染株

對于用于體內動物模型的穩定轉染細胞的獲得，陳亞靜等[15]研究發現用脂質體轉染、有限稀釋法獲得單克隆細胞株效率較低；而通過體內傳代，流式分選并單克隆化，是獲得致瘤性好，體內體外較為穩定的穩定轉染細胞株的一個可行方案。近期，陳媛等[16]亦利用逆轉錄病毒將非融合形式的綠色熒光蛋白質GFP和目的基因穩定整合至靶細胞的基因組中，經過流式分選獲得GFP陽性細胞，即為穩定表達目的蛋白的細胞株；該方法高效快捷，極大地提高了穩定細胞株的構建效率，同時該穩定細胞株的建立也為未知目的蛋白的功能研究提供了有用的工具。

4 結語

近年來，隨著各項科學技術的迅猛發展，多學科之間的相互結合成為大的趨勢。流式細胞分選術具有其自身特點及應用優勢，隨著其功能的不斷完善，必將成為高等院校及科研機構在醫學、生命科學、藥學、食品及化學等眾多學科實驗教學、科研的重要技術手段；該技術在監測、檢測、臨床等領域亦會有更廣泛、深入的應用前景。當然，精密、靈敏的儀器還需要精細的維護和日常校準，一個好的儀器共享平臺必將會為先進技術的應用提供有力的支撐與推動。

［1］石亞萍，種銀保，王晴.高端流式細胞分選儀的選型評價[J].醫療衛生裝備，2010，31(10)：122-124.

［2］楊蕊，鄒明強.流式細胞術的最新進展[J].分析測試學報，2004，23(6)：124-128.

［3］陶家平，陳捷光.流式細胞計無菌分選功能的開發[J].生物化學與生物物理進展，1990，17(6)：483-484.

［4］鄭海萍，李艷輝.流式細胞儀的原理及應用[J].醫療器械，2003，16(3)：286.

［5］王玲燕，王斌，馬清華，等.CD44+CD24-/low乳腺癌干細胞的流式分選及其腫瘤干細胞特性的初步鑒定[J].生物技術通訊，2012，23(1)：56-59.

［6］Yang Z F， Ngai P， Ho D W， et al.Identification of Local and Circulating Cancer Stem Cells in Human Liver Cancer[J].HEPATOLOGY，2008，47:919-928.

［7］Hassan K A， Wang L， Korkaya H， et al.Notch pathway activity identifies cells with cancer stem cell-like properties and correlates with worse survival in lung adenocarcinoma[J].Clinical cancer research， 2013， doi:10.1158/1078-0432.CCR-12-0370.

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［9］李璐，劉向宇，李德山.應用流式細胞儀分選中性粒細胞的研究[J].東北農業大學學報，2009，40(4)：52-55.

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［11］Vrána J， ?imková H， Kubaláková M， et al.Flow cytometric chromosome sorting in plants:The next generation[J].Methods， 2012， 57(3):331-337.

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［13］李喬，紀慶，王金宏.體外培養單個造血干細胞實驗方法的建立[J].中國藥理學通報，2012，28(3)：435-438.

［14］王萍，李潤今，高學文，等.經流式細胞儀分選神經細胞技術方法的建立[J].內蒙古醫學雜志，2008，40(12)：1416-1418.

［15］陳亞靜，蘇學今，王麗穎，等.通過體內傳代和流式分選建立穩定轉染 MUC1 VNTR 的 B16 細胞株[J].免疫學雜志，2008，24(1)：1-4.

［16］陳媛，鞏偉麗，韓秋影，等.逆轉錄病毒感染結合流式細胞分選方法構建穩定過表達 CUEDC2的 MCF-10A細胞系[J].科學技術與工程，2012，12(24)：6148-6151.