血栓形成及抗組織因子藥物研究進展

唐 寧 (南京曉莊學院生物化工與環境工程學院，江蘇 南京 211171)

血栓是指在機體血液中，由于血小板聚集或血液凝固等在心血管內形成的固體。無論是動脈血栓還是靜脈血栓，都能引起肺栓塞、心肌梗死或缺血性中風。生理性止血功能過度激活或動脈粥樣硬化斑塊破裂均易導致形成血栓。

1 機體凝血過程及血栓形成

正常情況下，小血管受損后引起的出血，在幾分鐘內就會自行停止，這種現象稱為生理性止血。生理性止血是機體重要的保護機制之一。生理性止血過程主要包括血管收縮、血小板血栓的形成和血液凝固三個過程。首先血管收縮使局部血流減少。然后血小板黏附于受損的內皮下組織，黏附后的血小板受到刺激釋放其顆粒中的腺苷二磷酸(ADP)、5-羥色胺、纖維蛋白原、凝血酶敏感蛋白等，除此以外也能釋放臨時合成的物質，如血栓烷A2，引發血小板聚集，形成血小板止血栓，從而將傷口堵塞，達到初步止血;受損的血管也可啟動凝血系統，通過內源性凝血途徑和外源性凝血途徑啟動機體凝血過程。內源性凝血途徑是指參與凝血的因子全部來自血液，通常因血液與帶負電的異物表面接觸而啟動。外源性凝血途徑由來自于血液之外的組織因子(TF)暴露于血而啟動的凝血過程。兩途徑都能形成凝血酶原酶復合物，激活凝血酶原使之形成凝血酶，后者又可使纖維蛋白原轉變為纖維蛋白，最終形成血栓。臨床研究發現，先天性缺凝血因子的患者，幾乎沒有出血癥狀，表明這些凝血因子并不是機體生理性止血機制所必需的，也即這些因子在機體生理性凝血的啟動中不起重要的作用。目前認為，外源性凝血途徑在機體生理性凝血反應的啟動中起關鍵性作用，組織因子是生理性凝血反應過程的啟動物，而內源性途徑對凝血反應開始后的維持和鞏固起非常重要的作用。如果機體內凝血機制過度激活，則容易導致血栓的形成。

2 TF的結構與功能

TF是一種跨膜糖蛋白，存在于大多數組織細胞。生理情況下，直接與循環血液接觸的血細胞和內皮細胞不表達組織因子。當血管受損時，暴露出TF，與血漿中的凝血因子結合，形成凝血酶原酶復合物。許多刺激因素如促炎癥因子、內毒素、氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)、黏附分子、切應力等都能誘導細胞表達 TF〔1〕。

TF是一種由263個氨基酸組成的單一多肽鏈，分子量為46 kD。TF的結構分為3部分：1～219位氨基酸構成胞外區，第49與57及186與209位半胱氨酸分別形成2個二硫鍵，該區含有4個可與FⅦ結合的關鍵氨基酸殘基。220～242位氨基酸構成跨膜區，為一疏水結構，與膜磷脂緊密結合。243～263位氨基酸殘基構成胞內區，含3個有功能活性的絲氨酸殘基，為蛋白激酶C的作用底物〔2〕。

TF可在平滑肌細胞、纖維細胞、單核細胞、淋巴細胞、粒細胞、血小板和內皮細胞中表達。組織損傷后，這些細胞入血，并快速激活凝血途徑。暴露于血液中的組織因子，與FⅦ結合，后者迅速轉變為FⅦa，稱為FⅦa-組織因子復合物，該復合物在Ca2+和磷脂存在時迅速激活FⅩ，生成FⅩa。在此過程中組織因子是輔因子，它能使FⅦa催化FⅩ激活的效力增加1000倍。生成的FⅩa又能反過來激活FⅦ，進而可使更多的FⅩ激活，形成外源性凝血途徑的正反饋效應。此外，FⅦa-組織因子復合物在Ca2+的參與下還能激活FⅨ，生成FⅨa。FⅨa除能與FⅦa結合而激活FⅩ外，也能反饋激活FⅦ。FⅦa-組織因子復合物的形成，使內源性凝血途徑和外源性凝血途徑相互聯系，共同完成凝血過程〔3〕。值得指出的是，在病理狀態下，細菌內毒免疫復合物、腫瘤壞死因子等均可襲擊血管內皮細胞和單核細胞表達組織因子，從而啟動凝血過程，引起彌散性血管內凝血〔4〕。如果抑制凝血連鎖反應的最后一步則會導致出血的并發癥〔5〕，因此可以將啟動凝血過程的TF/FⅦ作為靶點來進行抗血栓的治療〔6〕。

3 抗TF藥物

3.1 TF途徑抑制物(TFPI)TFPI是機體內源性組織因子抑制劑，有兩種異形體，即TFPI-1和TFPI-2，二者均有拮抗TF，抑制血栓形成的作用。TFPI-1和TFPI-2均屬于絲氨酸蛋白酶抑制物Kunitz家族成員〔7〕。TFPI通過Kunitz結構域與TF及FⅦ結合，形成TFPI/TF/FⅦ復合物，負反饋調節凝血途徑，起到抑制血栓形成的作用〔8〕。除此以外，TFPI還能通過抗炎和抑制基質金屬蛋白酶活性穩定動脈粥樣硬化斑塊，預防冠心病的發生。目前，人們已經可以通過基因工程的方法獲得大量重組的人源性TFPI，為臨床應用開辟了廣闊的空間。

3.2 抑制TF活性的天然化合物 從天然化合物中尋找TF抑制劑及其先導化合物對于抗血栓藥物的發現具有深遠意義。Lee等〔7〕以凝血酶原時間(PT)為檢驗指標，從木瓜果實的乙酸乙酯提取物中發現了5個對TF有抑制作用的黃酮類化合物。黃酮類化合物存在于水果、蔬菜、茶葉、紅酒、種子、中藥及香料等多種植物和食物中〔8〕。流行病學和實驗證實多食用富含黃酮類的食物可以降低心血管系統發病風險〔9〕。許多黃酮類化合物能夠抵抗炎癥，改善內皮功能，抑制血小板聚集〔10～12〕。Jiang等〔13〕合成篩選出12個具有代表性的黃酮類化合物，在脂多糖誘導的單核細胞中檢驗了其抑制TF的活性，探討了這些黃酮類化合物結構與活性的關系，其中有8個化合物的抑制作用呈劑量依賴型。

已發現的對TF有抑制作用的天然化合物大多具有活血化瘀或心血管保護作用，還有報道稱活血化瘀中藥復方補陽還五湯〔14〕對TF的表達也有抑制作用，其規律還有待進一步研究。

3.3 化學合成類抗組織因子藥物 Yang等〔15〕將研究小組合成的硫代磷酸寡核苷酸與熒光結合尾靜脈注射入小鼠體內，通過原位雜交、免疫組化等方法發現硫代磷酸寡核苷酸能明顯的抑制動脈血管狹窄模型中TF的表達，提示這種反義核苷酸藥物具有應用前景。

在很長一段時間內香豆素類是唯一一個口服有活性的抗凝血藥物。本類藥物的化學結構與維生素K類似，抑制了依賴維生素K的凝血因子的γ-羧化作用，從而影響凝血過程〔16〕。香豆素類抗凝作用持久，吸收后幾乎全部與血漿蛋白結合，與其他血漿蛋白結合率高的藥物同用時，可增加香豆素的游離藥物濃度，使其抗凝作用增強，甚至誘發出血〔17〕。Groebke等〔18〕合成了高活性、高選擇性的TF/FⅦ抑制劑，通過口服給藥途徑進入豚鼠體內后，發現其抗血栓效應稱劑量依賴型，并且不會延長出血時間。PHA2927和pyridinone37等有抑制TF/FⅦ活性的作用〔19〕，他汀類藥物可降低 TF 活性〔20〕，常規抗血小板藥，如阿司匹林、波利維等亦可通過抑制TF表達〔21〕，抑制冠狀動脈血栓形成。

3.4 抗TF藥物的靶向治療 由于TF首先與FⅦ作用啟動了外源性凝血機制，所以許多研究表明抑制TF與FⅦ的結合可以有效地抑制血栓的形成，而且這種方式比起其他經典的抗血栓治療能明顯地減少出血傾向〔22，23〕。凝血因子FⅦ輕鏈的N末端開始于含有一個Gla的區域，緊隨其后是兩個內皮生長因子樣的區域，表皮生長因子(EGF)1和EGF2〔24〕。最近的研究表明EGF1在和組織因子的結合中起著重要作用〔25，26〕。因此Mei等〔27，28〕將 EGFP-EGF1 融合蛋白與納米顆粒(NP)相結合，形成EGFP-EGF1-NP藥物運載體，并且在這種球粒中嵌合了熒光染料。體外培養大鼠主動脈內皮細胞，通過熒光顯微技術和流式細胞術結果發現EGFP-EGF1-NP能特異性的結合到TF細胞的表面，對血栓有高特異性和高靈敏度。說明EGFP-EGF1-NP是一種很有前途的鐵蛋白靶向藥物溶栓治療傳送系統。該研究還表明這種新型的藥物運載體系的細胞毒性很低，具有較好的生物相容性。

4 展望

TF在凝血及血栓形成中的作用已經明確，以TF為靶點的抗血栓藥物治療具有切實的臨床意義。隨著分子生物學與基因工程的發展與應用，安全、高效的組織因子抑制劑將研制成功并應用于臨床，在抗血栓方面發揮積極的作用，帶來極大地社會效益和經濟效益。

1 Maly MA，Tomasov P，Hajek P，et al.The role of tissue factor in thrombsis and hemostasis〔J〕.Physiol Res，2007;56(6)：685-95.

2 Ten GH.Pathophysiology of disseminated intravascular coagulation in sepsis〔J〕.Crit Care Med，2000;28(9 Suppl)：9-11.

3 Hanessian S，Therrien E，Zhang J，et al.From natural products to achiral drug prototypes：potent thrombin inhibitors based on P2/P3 dihydropyrid-2-one core motifs〔J〕.Bioorg Med Chem Lett，2009;19(18)：5429-32.

4 Meisel SR，Ouyang Y，Fishbein MC，et al.Prolonged hypercholesterolemia-induced tissue factor expression in rabbit vein grafts：a potential mechanism for graft failure〔J〕.Coron Artery Dis，2010;21(2)：97-103.

5 Petersen LC，Sprecher CA，Foster DC，et al.Inhibitory properties of a novel human Kunitz-type protease inhibitor homologous to tissue factor pathway inhibitor〔J〕.Biochemistry，1996;35(1)：266-72.

6 Chand HS，Du X，Ma D，et al.The effect of human tissue factor pathway inhibitor on the growth and metastasis of fibrosarcoma tumors in a thymic mice〔J〕.Blood，2004;103(3)：1069-77.

7 Lee MH，Son YK，Ha YN.Tissue factor inhibitor flavonoids from the fruits of Chaenomeles sinensis〔J〕.Arch Pharm Res，2002;25(8)：42-50.

8 Graf BA，Milbury PE，Blumberg JB.Flavonols，flavones，flavanones and human health：epidemiological evidence〔J〕.J Med Food，2005;8(3)：281-90.

9 Erdman JW Jr，Balentine D，Arab L，et al.Flavonoids and heart health：proceedings of the ILSI North America Flavonoids Workshop，May 31-June 1，2005，Washington，DC〔J〕.J Nutr，2007;137(3 Suppl 1)：718-37.

10 Kris-etherton P M，Keen C L.Evidence that antioxidant flavonoids in tea and cocoa are beneficial for cardiovascular health〔J〕.Curr Opin Lipidol，2002;13(1)：41-9.

11 Rein D，Paglieroni TG，Wun T，et al.Cocoa inhibits platelet activation and function〔J〕.Am J Clin Nutr，2000;72(1)：30-5.

12 Vita JA.Polyphenols and cardiovascular disease：effects on endothelial and platelet function〔J〕.Am J Clin Nutr，2005;81(1 Suppl)：292-7.

13 Jiang W，Kou J，Zhang Z，et al.The effects of twelve representative flavonoids on tissue factor expression in human monocytes：structure-activity relationship〔J〕.Thromb Res，2009;124(6)：714-20.

14 Wen Z，Shang G，He X，et al.Effects of Buyang huanwu decoction on the release of vWF，NO and TFPI and the expression of tissue factor induced by thrombin in cultured bovine aortic endothelial cells〔J〕.Bull Hunan Med Univ(湖南醫科大學學報)，2002;27(4)：315-8.

15 Yang YM，Li QN，Ying DJ，et al.Triplex-forming oligonucleotide inhibits the expression of tissue factor gene in endothelial cells induced by the blood flow shear stress in rats〔J〕.Acta Pharmaceutica Sinica(藥學學報)，2006;41(9)：808-13.

16 Jorge E，Pego JM，Baptista R，et al.Genetic characterization of warfarin sensitivity in a population of cardiovascular patients on chronic anticoagulation〔J〕.Rev Port Cardiol，2010;29(12)：1831-8.

17 Makris M，Van Veen JJ.Three or four factor prothrombin complex concentrate for emergency anticoagulation reversal〔J〕?Blood Transfus，2011;9(2)：117-9.

18 Groebke ZK，Banner DW，Hilpert K，et al.Dose-dependent antithrombotic activity of an orally active tissue factor/factorⅦa inhibitor without concomitant enhancement of bleeding propensity〔J〕.Bioorg Med Chem，2006;14(15)：5357-69.

19 Young WB，Mordenti J，Torkelson S，et al.FactorⅦa inhibitors：chemical optimization，preclinical and efficacy in an arterial baboom thrombosis model〔J〕.Bioorg Med Chem Lett，2006;16(7)：2037-41.

20 Zawadzki C，Susen S，Richard F，et al.Dyslipidemia shifts the tissue factor and tissue factor pathway inhibitor balance toward increased thrombogenicity in atherosclerotic plaques：evidence for a corrective effect of statins〔J〕.Therosclerosis，2007;195(2)：117-25.

21 Rao AK，Vaidyula VR，Bagga S，et al.Effect of antiplatelet agents clopdogrel，aspirin，and cilostazol on circulating tissue factor procoagulant activity in patients with peripheral arterial disease〔J〕.Thromb Haemost，2006;96(6)：738-43.

22 Golino P，Cimmino G.Targeting tissue factor as an antithrombotic strategy〔J〕.Semin Vasc Med，2003;3(2)：205-14.

23 Golino P.The inhibitors of the tissue factor：factor Ⅶ pathway〔J〕.Thromb Res，2002;106(3)：257-65.

24 Ndonwi M，Broze GJ，Bajaj SP.The first epidermal growth factor-like domains of factor Xa and factor IXa are important for the activation of the factor VII--tissue factor complex〔J〕.J Thromb Haemost，2005;3(1)：112-8.

25 Pike AC，Brzozowski AM，Roberts SM，et al.Structure of human factorⅦa and its implications for the triggering of blood coagulation〔J〕.Proc Natl Acad Sci U S A.，1999;96(16)：8925-30.

26 Eigenbrot C.Structure，function，and activation of coagulation factor Ⅶ〔J〕.Curr Protein Pept Sci，2002;3(3)：287-99.

27 Mei H，Hu Y，Wang H，et al.Binding of EGF1 domain peptide in coagulation factor VII with tissue factor and its implications for the triggering of coagulation〔J〕.J Huazhong Univ Sci Tech Med Sci，2010;30(1)：42-7.

28 Mei H，Shi W，Pang Z，et al.EGFP-EGF1 protein-conjugated PEG-PLA nanoparticles for tissue factor targeted drug delivery〔J〕.Biomaterials，2010;31(21)：5619-26.