申克孢子絲菌聚合酶鏈反應診斷及其相關技術的研究進展

田超群綜述，周 汛審校（重慶醫科大學附屬第一醫院皮膚科 400016）

孢子絲菌病又稱玫瑰花園丁病，是由申克孢子絲菌引起的皮下組織真菌病，孢子絲菌由Schenck于1898年在美國分離[1]。申克孢子絲菌分布于全球的土壤中，而孢子絲菌病則局限于墨西哥、中南美洲和其他地區，最常見的感染方式是皮膚接種，最典型皮損是淋巴皮膚型或者孢子絲菌病樣型，即原發部位感染后沿淋巴管播散的類型。申克孢子絲菌為一種雙相型真菌，在室溫25℃下為菌絲相，37℃下為酵母相，酵母相可在感染者體內增殖，形成小的芽生孢子而致病[1]。臨床上常根據患者病史、皮損狀況、組織真菌分離培養、組織病理觀察、血清學、免疫組化檢測等方法診斷孢子絲菌病，但傳統診斷方法不僅耗費時間且誤診率高。因此研究一項快速靈敏，特異性高的診斷技術十分必要。分子生物學診斷方法尤其是聚合酶鏈反應（PCR）及其相關技術，不但簡單、快捷，且特異性高，近年來越來越受人們的重視。

1 PCR技術

從1994年Chua等[2]報道使用PCR技術檢測申克孢子絲菌以來，基于其操作簡單、快捷、準確性高等優點，這項技術越來越多地被人們用于孢子絲菌的研究。PCR技術不僅可用于檢測環境中、動物組織、臨床皮損中的孢子絲菌，還可用于孢子絲菌與相關類群的分類學研究，發現新的種類，且可用于菌株耐藥性研究。朱建國等[3]篩選出申克孢子絲菌特異性引物S2－R2成功鑒定了動物組織、人石蠟切片和臨床皮損中的孢子絲菌。應用該引物檢測石蠟切片中的孢子絲菌陽性率高達91%，檢測臨床新鮮活組織中的孢子絲菌，以真菌培養為參照，陽性率可達100%。該方法能夠快速、準確地檢測出孢子絲菌，敏感性及特異性很高，可以用于臨床快速診斷孢子絲菌病。Liu等[4]采用相同的方法檢測臨床皮損中的孢子絲菌，83.3%（25/30）的皮損中可檢測出孢子絲菌，且PCR檢測出的孢子絲菌皮損的病例有95.6%真菌培養為陽性。2007年Marimon等[5]采用PCR技術聯合不同培養基、不同溫度菌株生長率等方法將127例孢子絲菌分為7類，包括S.mexicana、S.brasiliensis、S.globosa和S.schenckii等，并且發現前面3種新分類，這種分類方法一直被世界公認。Oliveira等[6]應用表型實驗（phenotypic test）及PCR技術（以鈣調蛋白基因為引物）研究40例S.schenckii（包括31例從人體分離的菌株和9例從動物分離的菌株）及其對抗真菌藥物的敏感性，結果這40例申克孢子絲菌被分成了4類：S.albicans（n＝1）、S.brasiliensis（n＝1）、S.lueiei（n＝1）和S.schenckii（n＝37），他們的實驗得出S.albicans和S.lueiei對伊曲康唑耐藥，且對所有唑類藥物耐藥性均較高。從動物分離的孢子絲菌對伊曲康唑的耐藥性高于從人體分離的菌株，但對于特比萘芬和兩性霉素B所有菌株的敏感性相差不大，因此，孢子絲菌的準確分類對于治療藥物的選擇是相當重要的。PCR還可用于孢子絲菌雙向轉換技術的研究，Valle－Aviles等[7]用PCR檢測出鈣/鈣調蛋白激酶家族中的新成員：SSCMK1，它可能參與孢子絲菌的雙向轉換。

2 巢式PCR技術

巢式PCR同PCR一樣不僅可用于孢子絲菌診斷，還可用于孢子絲菌分類及其對抗真菌藥物的研究，而且有的實驗還證明巢式PCR比普通PCR檢測孢子絲菌的靈敏性更高[8]。王連明等[9]運用巢式PCR及特異性引物來檢測實驗小鼠組織中的申克孢子絲菌，11只有明顯皮損表現的小鼠中9只可檢測出申克孢子絲菌特異性DNA，但并不是所有研究都表明巢式PCR技術優于傳統方法。Mendoza等[10]比較真菌鏡檢、真菌培養、巢式PCR技術和血清學檢測小鼠器官中的孢子絲菌，其中真菌培養和抗體檢測陽性率較高，而巢式PCR技術和真菌鏡檢的陽性率稍低。巢式PCR技術還可用于孢子絲菌分類，Xu等[11]運用巢式PCR技術檢測38株不同地方的孢子絲菌，他們研究的菌株包括從動物和人體分離的孢子絲菌，并和其他類型的真菌作比較，結果表明巢式PCR技術對于鑒別不同種類的申克孢子絲菌具有很高的敏感性和特異性，為孢子絲菌病的快速診斷提供了一種新方法。Galhardo等[12]分別從申克孢子絲菌的表型和基因型研究菌株對抗真菌藥物的最低抑菌濃度，其研究表明菌株的耐藥性和基因型是密切相關的，而不同地區的孢子絲菌對抗真菌藥物的耐藥性也是不同的。

3 限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應（PCR－RFLP）技術

PCR－RFLP技術主要應用于孢子絲菌菌種的鑒別，由于其標記需使用內切酶，對實驗室及操作人員要求較高，近年來研究較少。Kawasaki等[13]運用線粒體DNA聯合PCR－RFLP技術鑒別申克孢子絲菌的兩種不同基因型菌株American Type Culture Collection 10268of mtDNA type 1和KMU2025of mtDNA type 4，這兩種菌株主要不同點定位于atp9和cox2基因，并且發現這種運用限制性內切酶Asel的方法比其他運用核DNA內部轉錄區間的PCR－RFLP技術更適合于孢子絲菌種的鑒別。

4 反向PCR技術

反向PCR技術主要用于孢子絲菌的雙向轉換機制及其基因結構研究，對于了解孢子絲菌病的致病機制有重要意義。Robledo－Ortiz等[14]運用反向PCR技術及簡并引物發現了申克孢子絲菌內質網葡萄糖苷酶Ⅱ的編碼基因rot2，這個基因編碼的蛋白與孢子絲菌的結構、致病性及免疫有關。Hou等[15]的實驗中用實時定量的反向PCR技術表明SsDRK1基因在孢子絲菌的酵母相中比菌絲相中表達更高，表明SsDRK1基因可能與孢子絲菌的雙向轉換機制有關。Nishizawa等[16]發現在申克孢子絲菌的雙相轉換中Pho85細胞周期素依賴激酶的表達被抑制。通過定量反向PCR檢測到在酵母相向菌絲相轉換中PhoSs基因的表達下降了30倍，表明PhoSs可能參與申克孢子絲菌雙相轉換的調控。

5 其他PCR相關技術

其他PCR相關技術，例如交錯式熱不對稱PCR（TAILPCR）、隨機擴增多態性DNA（PAPD）等常用于孢子絲菌的流行病學及轉基因等。Zhang等[17]將玉米轉基因系統用于申克孢子絲菌的插入誘變研究中，并運用TAIL－PCR克隆T－DNA（Transferred DNA轉化DNA），為未來醫學上重要真菌的正向和反向遺傳學研究提供了重要的突變體。Reis等[18]運用PAPD技術及DNA指紋分析技術分析了里約熱內盧19例從人體分離的孢子絲菌、25例從貓分離的孢子絲菌和2例其他來源的孢子絲菌，實驗表明里約熱內盧的動物和人孢子絲菌病有共同的傳染源，同時貓在孢子絲菌病的播散中起重要作用。

PCR及其相關技術具有快速、簡單、敏感、特異性高等優點，不僅能用于快速診斷孢子絲菌病，還能用于孢子絲菌的分類、藥物選擇、孢子絲菌病的流行病學研究等方面，具有較大發展空間，是今后孢子絲菌病診斷及孢子絲菌研究的發展方向。對于孢子絲菌病的診斷，尤其對于臨床表現不典型及系統性播散型孢子絲菌病的診斷具有更重大的意義，可以明顯降低孢子絲菌病的誤診率。而且這些技術能幫助研究孢子絲菌的雙向轉化機制，對其致病性有更好的了解，能從病因上研究孢子絲菌病。但這些技術由于對操作人員技術及實驗室條件要求高，目前僅用于實驗室診斷孢子絲菌病，暫未能在臨床上大量推廣。隨著分子生物學技術的不斷發展，相信在不久的將來會成為孢子絲菌病臨床快速、準確診斷的手段。目前發現與孢子絲菌雙向轉化相關的基因不多，對其雙向轉化機制尚不能完全明確，這需要科學工作者作出更大的努力。相信隨著新技術的不斷開發和研究的進展，最終會明確孢子絲菌雙向轉化的機制。

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