核磷酸酶基因與腫瘤發生和發展的研究＊

舒 婷綜述，姚 軍審校（臺州學院椒江校區醫學院醫學檢驗系，浙江臺州 318000）

磷酸酶基因（PTEN）基因即與張力蛋白同源在10號染色體有缺失的PTEN具有調節細胞周期，抑制腫瘤細胞生長、侵襲、轉移以及誘導腫瘤細胞凋亡等功能。由于該基因在人類多種腫瘤細胞中存在突變或缺失，因此它被認為是繼p53基因之后發現的又一重要的抑癌基因[1]。在一些癌變組織中都有PTEN不同程度的突變或丟失，如神經膠質瘤、進展期的前列腺癌、乳腺癌、子宮內膜癌、腎腫瘤、小細胞肺癌和皮膚黑色素瘤等[1]。PTEN的分布具有組織特異性，在皮膚、結腸、乳腺、前列腺等組織細胞中，PTEN主要分布于細胞質中；在神經細胞、成纖維細胞、腎上腺髓質、甲狀腺等組織細胞中，PTEN分布于細胞核中；在極化的MDCK犬腎細胞，PTEN位于細胞間的緊密連接處[2－3]。細胞質PTEN具有負調控磷脂酰肌醇－3－羥基激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（PI3K/AKT）信號轉導通路的作用[4]；但新近的研究表明，PTEN的核移位可能促成其腫瘤抑制活性[3]。

1 PTEN的結構與功能

PTEN定位于10q23.3染色體，全長200kb，包含9個外顯子和8個內含子。其cDNA的5′端是由804個核苷酸組成的非編碼區，含多個CGG三核酸重復序列，為甲基化提供了基礎[1]。PTEN的高甲基化使基因處于靜止狀態，導致PTEN低水平轉錄及PTEN蛋白的減少甚至缺失[1]。非編碼區后是開放閱讀框，由1 209個核苷酸組成，PTEN mRNA長5.5kb，編碼403個氨基酸的蛋白產物。PTEN的第5外顯子十分重要，參與編碼PTEN蛋白磷酸酶核心基序[1]。

PTEN蛋白由N端的磷酸酶結構域、C2結構域及C端結構域組成[5]。PTEN蛋白的C端尾部結構域是一個由約50個氨基酸組成的，主要包括2個氨基酸單字母編碼（PEST）結構域序列和一個 PDZ（PSD－95/Dig/ZO1）同源結構域結合序列[5]。PEST結構域序列為一富含脯氨酸（P）、谷氨酰胺（E）、絲氨酸（S）、蘇氨酸（T）等10個氨基酸組成的結構序列[5]。PEST結構域序列有助于蛋白折疊，若其缺失將導致PTEN的降解速度加快[5]。因此，PEST序列的存在對PTEN蛋白的穩定性和細胞膜定位有一定作用，如果將其敲除，則可通過影響蛋白折疊導致PTEN表達下降[6]。PDZ同源結構域結合序列位于C末端的第400～403位氨基酸，是蛋白質間相互作用的結構域[5]。其主要通過參與蛋白質間的相互作用來增強PTEN磷酸酶活性和信號通路的轉導效率，即PTEN蛋白可通過PDZ結構域結合序列與其他含有PDZ結構域結合序列的蛋白相互作用而影響PTEN功能，也有維護PTEN蛋白穩定性的作用[5]。

PTEN蛋白的N端有1段與細胞張力蛋白、輔助蛋白同源的序列，含有177個氨基酸，為主要的結構功能區[7]。細胞張力蛋白是一種細胞骨架蛋白，而輔助蛋白與神經突觸小泡的運輸有關[7]。PEST同源結構域有助于蛋白折疊，如果其缺失將導致PTEN迅速降解；PDZ結合基序的缺失不影響PTEN降解，不過它可與PDZ蛋白相互作用，可能有利于PTEN的定位以及與別的蛋白質的相互作用[7]。PTEN通過PDZ結合基序與上皮細胞膜緊密連接上膜相關反向鳥苷酸激酶－2的PDZ結構域結合，來加強PTEN抑制 Akt活性[8]。由此可見PTEN的C端特殊區域在調節PTEN的穩定性和酶活性方面非常重要，其突變可逆轉抑癌基因的表型，影響突變體的穩定性和磷酸酶活性[8]。

2 PTEN的核轉位機制

PTEN如何進入核內是目前的研究熱點之一，有研究表明泛素化能調控PTEN的核輸入。Trotman等確認Cowden綜合征家族患者PTEN的1個賴氨酸突變為谷氨酸（K289E），他們通過分析有這種生殖細胞突變患者的腸息肉，展示了K289E突變蛋白已從發育異常的上皮細胞核中除去，進一步展示了超量表達的綠色熒光蛋白（GFP）－PTEN，K289E融合蛋白主要位于細胞質，而野生型GFP－PTEN融合蛋白在細胞核和細胞質中都存在[9]。PTEN的這種分布異常與其磷酸酶活性無關，而是由于細胞核輸入的極大降低（無細胞核輸出增加）導致的[9]。此外賴氨酸13被確認是轉染細胞內的第2個泛素化位點[9]。這個最初在散發腦腫瘤患者中發現的賴氨酸突變體K13E中斷了PTEN的核轉位，并減少了PTEN核輸入[9]?？梢奒289和K13這2個賴氨酸殘基作為泛素化位點，是PTEN穿梭和核輸入所必需的[9]。

泛素化是由一系列酶連續催化的反應，研究表明核內PTEN隨著泛素化的增加而劇烈增加，尤其是單泛素化[9－11]。PTEN受多泛素化影響而在胞漿內儲留，并最終被蛋白酶體降解[9－11]。單泛素化的PTEN在核內特異濃縮，這證實單泛素化的PTEN是最有效的穿梭模式，但具體機制尚不明確[9－11]?？赡苁怯捎趩畏核鼗ㄟ^某些機制增強了PTEN核輸入的信號，或者通過其他獨立的進程所致。而且核定位的PTEN與染色體的穩定性有關，神經前體細胞表達的進行性下調基因（NEDD4－1）可通過泛素化調控 PTEN 入核和抑癌作用[9]。PTEN泛素化是通過NEDD4－1介導的，其生理過程非常復雜[10]。NEDD4－1是PTEN主要的E3泛素化連接酶，可以連同PTEN其他位點一起泛素化K289[11]。抑制NEDD4－1能使PTEN在胞漿內重新分配，而NEDD4－1過度表達將增加PTEN的核轉位[11]。

單泛素化的PTEN富含于核碎片中，不是所有的核PTEN都能被單泛素化，這提示PTEN在細胞核中被泛素移除或者部分核PTEN沒有通過泛素化進入核內[11]。顯然，針對核中PTEN去泛素化酶的鑒定，可解釋另一調節PTEN穩定和定位的規律。與此相反，單泛素化能介導PTEN進入核內并增加其穩定性[9]，然而通過NEDD4－1介導的PTEN多泛素化會加強PTEN的降解[10]。雖然核內的單泛素化PTEN濃縮增多，但PTEN并不都是通過單泛素化入核的，這表明PTEN在核內有去泛素化，或者一部分PTEN沒有經過泛素化入核，但這一機制尚不清楚[9－11]。

3 核PTEN的功能

核PTEN對細胞的許多生物學功能均有影響：（1）與p53形成的核內復合體能抑制p53降解并增加p53的轉錄活性[12－13]；（2）可不依賴于抑制 Akt的活性來阻止細胞的增殖[14]；（3）可下調細胞周期蛋白 D1（Cyclin D1）水平并能阻止絲裂原活化蛋白激酶磷酸化[15]；（4）調控PIP結合受體類固醇生成因子－1和肝臟受體類似物的活性[16－17]；（5）外源性PTEN入核可增加細胞凋亡[3]；（6）參與維持染色體的穩定性[3]。

4 核PTEN與腫瘤

核PTEN是怎樣抑制腫瘤發生和發展的呢？最近研究發現，PTEN可以通過單泛素化進入細胞核，并通過誘導細胞周期停滯和維持染色體完整性而起到腫瘤抑制的作用[18]。Shen等[18]發現阻止PTEN表達可造成染色體破碎片段增加，從而出現著絲粒和染色體易位。核PTEN有維持染色體穩定和完整的功能，可能是通過與著絲粒特異結合蛋白－C的相互作用以維持染色體的穩定性來促進DNA修復家族Rad51轉錄調節的修復及減少DNA雙鏈的斷裂。因此，核PTEN可能和p53蛋白一樣，可以起到維持基因組穩定的作用。

4.1 核PTEN與胃癌 胃癌是一種常見的惡性腫瘤，目前認為胃癌的發生、發展是一個有序的、多階段、多步驟的過程，并且是多種因素的綜合結果，但主要是因為抑癌基因的失活和癌基因的活化。核PTEN表達下調的分子基礎是由基因突變、過度甲基化等構成。Hino等[19]發現，胃癌組織中核PTEN有較高的陰性表達率，并伴有mRNA及總蛋白水平降低。Wang等[20]也發現，60例進展期胃癌中有17例（28.3%）存在核PTEN基因突變，其中包括8例錯義突變、5例沉默突變、2例無義突變、1例堿基缺失和1例內含子拼接供體位點突變。因此，核PTEN基因突變在進展期胃癌的發生中可能起重要作用。

Bai等[21]研究表明，核PTEN高表達的腫瘤患者預后顯著好于核PTEN低表達的患者，核PTEN和淋巴結轉移呈負相關，分化程度低的胃癌患者低表達核PTEN。核PTEN的表達還與Lauren′s分型有關，說明了核PTEN可能抑制胃癌的發生和發展，與既往在細胞質表達的PTEN研究結果相一致[22]。因此，核PTEN可能作為胃癌分子分型的潛在生物標志物和治療靶點。

4.2 核PTEN與結腸癌 核PTEN在正常結腸黏膜組織的表達也顯著多于結腸癌組織，而且核PTEN的表達與結腸癌腫瘤的體積及血液轉移的發生呈負相關[23]。有其他研究發現，核PTEN的表達在正常組織－腺瘤－腺癌－轉移這一序列中依次下降，提示核PTEN表達對于結腸癌的發生和發展至關重要，并發現核PTEN表達的缺失是Ⅱ期結腸癌患者預后不良的重要指標之一[24]。

4.3 核PTEN與其他腫瘤 Gil等[25]研究發現PTEN磷酸化影響其核、質定位。PTEN的第380位上的絲氨酸被丙氨酸取代和第383位上的蘇氨酸被丙氨酸取代突變體主要定位于細胞核中，由于該突變體不能發生磷酸化修飾，提示非磷酸化PTEN更傾向定位于細胞核。然而Chung等[26]用同樣的PTEN突變體在人乳腺癌MCF－7細胞中研究卻未發現突變對PTEN核、質定位有影響。體外突變體實驗得到的這些矛盾結果促使學者對內源性PTEN磷酸化與其核、質定位的關系進行深入研究。有研究表明，細胞缺氧24h時，細胞核中PTEN蛋白含量明顯增高，而Westem blot結果顯示磷酸化的PTEN降低，總蛋白未見降低，即非磷酸化的PTEN蛋白增多，提示缺氧可降低PTEN磷酸化水平，促進PTEN的核定位[27]，這與Gil等[25]發現的非磷酸化PTEN傾向定位于細胞核的現象一致。

在舌鱗癌組織中，PTEN蛋白的表達主要定位于細胞核，PTEN的陽性率缺失表達可能參與舌鱗癌組織的分化過程。核PTEN通過拮抗低氧誘導因子－1α、基質金屬蛋白酶－9，而在舌鱗癌的發生、發展和侵襲過程中發揮抑制作用[28]。在人神經膠質細胞瘤U251MG細胞中，不需抑制Akt信號轉導通路，核內的PTEN就能夠抑制癌細胞的生長，促使細胞增殖停滯在G1期[14]。又有研究發現，肝癌組織中53.1%的核PTEN呈陽性，而核PTEN蛋白的表達與患者年齡、性別、腫瘤大小及分化程度均無相關性[29]。NEDD4－1并不是在所有情況中都具有致癌性，因為其并不能完全消除PTEN水平[11]。在大量浸潤性膀胱癌標本中，發現浸潤性膀胱癌與NEDD4－1的升高和PTEN蛋白減少存在一定聯系，但是在NEDD4－1和PTEN表達之間不存在持續性負相關，這可從NEDD4－1為調控PTEN穩態水平的主要調節因子這一簡易模型中預測到[11]。

5 結語及展望

盡管核PTEN及細胞質PTEN均有腫瘤抑制功能，在腫瘤的發生和發展中起重要作用，但是核PTEN的作用及其機制與細胞質PTEN是不盡相同的。越來越多的證據表明，是否有多個PTEN的核輸入機制取決于細胞類型和細胞內外微環境。核PTEN在調節細胞動態平衡和穩定中起強有力的作用，它有助于維持染色體的穩定，促進DNA修復和誘導細胞周期阻滯。針對核PTEN的研究將有助于深入探索PTEN與腫瘤發生和發展的關系，還有助于在分子水平上揭示腫瘤的發生、發展、浸潤和轉移機制，為篩選腫瘤標志物、早期診斷和尋找有效治療方法打下基礎。

[1] Song MS，Salmena L，Pandolfi PP.The functions and regulation of the PTEN tumour suppressor[J].Nat Rev Mol Cell Biol，2012，13（5）：283－296.

[2] Hamada K，Sasaki T，Koni PA，et al.The PTEN/PI3K pathway governs normal vascular development and tumor angiogenesis[J].Genes Dev，2005，19（17）：2054－2065.

[3] Planchon SM，Waite KA，Eng C.The nuclear affairs of PTEN[J].J Cell Sci，2008，121（Pt 3）：249－253.

[4] Martelli AM，Evangelisti C，Chappell W，et al.Targeting the translational apparatus to improve leukemia therapy：roles of the PI3K/PTEN/Akt/mTOR pathway[J].Leukemia，2011，25（7）：1064－1079.

[5] HlobilkováA，KnillováJ，Bártek J，et al.The mechanism of action of the tumour suppressor gene PTEN[J].Biomed Pap Med Fac Univ Palacky Olomouc Czech Repub，2003，147（1）：19－25.

[6] Torres J，Rodriguez J，Myers MP，et al.Phosphorylationregulated cleavage of the tumor suppressor PTEN by caspase－3：implications for the control of protein stability and PTEN－protein interactions[J].Biol Chem，2003，278（33）：30652－30660.

[7] Rodríguez－Escudero I，Oliver MD，Andrés－Pons A，et al.A comprehensive functional analysis of PTEN mutations：implications in tumor－and autism－related syndromes[J].Hum Mol Genet，2011，20（21）：4132－4142.

[8] Tolkacheva T，Boddapati M，Sanfiz A，et al.Regulation of PTEN binding to MAGI－2by two putative phosphorylation sites at threonine 382and 383[J].Cancer Res，2001，61（13）：4985－4989.

[9] Trotman LC，Wang X，Alimonti A，et al.Ubiquitination regulates PTEN nuclear import and tumor suppression[J].Cell，2007，128（1）：141－156.

[10] Wang X，Trotman LC，Koppie T，et al.NEDD4－1is a proto－oncogenic ubiquitin ligase for PTEN[J].Cell，2007，128（1）：129－139.

[11] Baker SJ.PTEN enters the nuclear age[J].Cell，2007，128（1）：25－28.

[12] Freeman DJ，Li AG，Wei G，et al.PTEN tumor suppressor regulates p53protein levels and activity through phosphatase－dependent and－independent mechanisms[J].Cancer Cell，2003，3（2）：117－130.

[13] Su JD，Mayo LD，Donner DB，et al.PTEN and phosphatidylinositol 3′－kinase inhibitors up－regulate p53and block tumor－induced angiogenesis：evidence for an effect on the tumor and endothelial compartment[J].Cancer Res，2003，63（13）：3585－3592.

[14] Liu JL，Sheng X，Hortobagyi ZK，et al.Nuclear PTEN－mediated growth suppression is Independent of Akt down－regulation[J].Mol Cell Biol，2005，25（14）：6211－6224.

[15] Chung JH，Eng C.Nuclear－cytoplasmic partitioning of phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10（PTEN）differentially regulates the cell cycle and apoptosis[J].Cancer Res，2005，65（18）：8096－8100.

[16] Krylova IN，Sablin EP，Moore J，et al.Structural analyses reveal phosphatidyl inositols as ligands for the NR5orphan receptors SF－1and LRH－1[J].Cell，2005，120（3）：343－355.

[17] Ortlund EA，Lee Y，Solomon IH，et al.Modulation of human nuclear receptor LRH－1activity by phospholipids and SHP[J].Nat Struct Mol Biol，2005，12（4）：357－363.

[18] Shen WH，Balajee AS，Wang J，et al.Essential role for nuclear PTEN in maintaining chromosomal integrity[J].Cell，2007，128（1）：157－170.

[19] Hino R，Uozaki H，Murakami N，et al.Activation of DNA methyltransferase 1by EBV latent membrane protein 2A leads to promoter hypermethylation of PTEN gene in gastric carcinoma[J].Cancer Res，2009，69（7）：2766－2774.

[20] Wang JY，Huang TJ，Chen FM，et al.Mutation analysis of the putative tumor suppressor gene PTEN/MMAC1in advanced gastric carcinomas[J].Virchows Arch，2003，442（5）：437－443.

[21] Bai Z，Ye Y，Chen D，et al.Homeoprotein Cdx2and nuclear PTEN expression profiles are related to gastric Cancer prognosis[J].APMIS，2007，115（12）：1383－1390.

[22] Semba S，Satake S，Matsushita M，et al.Phosphatase activity of nuclear PTEN is required for CDX2－mediated intestinal differentiation of gastric carcinoma[J].Cancer Lett，2009，274（1）：143－150.

[23] Hsu CP，Kao TY，Chang WL，et al.Clinical significance of tumor suppressor PTEN in colorectal carcinoma[J].Eur J Surg Oncol，2011，37（2）：140－147.

[24] Jang KS，Song YS，Jang SH，et al.Clinicopathological significance of nuclear PTEN expression in colorectal adenocarcinoma[J].Histopathology，2010，56（2）：229－239.

[25] Gil A，Andrés－Pons A，Fernández E，et al.Nuclear localization of PTEN by a Ran－dependent mechanism enhances apoptosis：Involvement of an N－terminal nuclear localization domain and multiple nuclear exclusion motifs[J].Mol Biol Cell，2006，17（9）：4002－4013.

[26] Chung JH，Ginn－Pease ME，Eng C.Phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10.（PTEN）has nuclear localization signal－like sequences for nuclear import mediated by major vault protein[J].Cancer Res，2005，65（10）：4108－4116.

[27] 周云英，劉華，郭銳翰，等.缺氧影響PTEN磷酸化和核定位[J].首都醫科大學學報，2011，32（2）：244－248.

[28] 李善昌，劉芷君.HIF－1α、MMP－9及PTEN在舌鱗癌組織中的表達及意義[J].口腔醫學研究，2011，27（10）：896－898.

[29] Hu TH，Wang CC，Huang CC，et al.Down－regulation of tumor suppressor gene PTEN，overexpression of p53，plus high proliferating cell nuclear antigen index predict poor patient outcome of hepatocellular carcinoma after resection[J].Oncol Rep，2007，18（6）：1417－1426.