哺乳動物細胞轉染技術概述

張榮華 王冰

哈藥集團技術中心 黑龍江哈爾濱 150025

為了達到基因治療的目的，目前已經建立許多基因轉導的方法，這些方法為基因治療的最新進展做出了很大的貢獻。哺乳動物細胞轉染技術就是將構建出來的目的基因通過載體導入不同的哺乳動物細胞內，進行基因功能研究的方法，轉染大致可分為物理轉導、化學轉導和病毒轉導三種途徑。

物理轉導

是利用物理力量導致細胞膜的瞬間缺損，從而使DNA 質粒進入細胞內的方法，如電穿孔法、基因槍法、注射法等。

注射法:直接將DNA 質粒注射入組織細胞中以達到基因轉導的目的。注射法還可以將裸露的DNA 質粒注射入肌肉、肝臟、皮膚等組織，有研究報道將DNA 質粒逆行注入到肝靜脈和膽管后能夠高效表達［1］。

基因槍法:是把壓縮氣體(氮或氦)轉換成氣體時所產生的沖擊波作為動力，把DNA 質粒直接射入組織、細胞和細胞器中，基因槍導入的基因被證明可在各種類型的細胞中得到瞬時高效表達。

電穿孔法:通過短暫高強度的電場作用，瞬時提高細胞膜的通透性，將DNA 質粒導入細胞內。電穿孔法是一種既可以用于體外也可以用于體內的基因轉移方法。目前體內用電穿孔法導入基因主要用于皮膚和肌肉組織。Molnar 等于2004 年［2］，采用電穿孔法將外源基因導入免疫缺陷鼠體內，此基因穩定表達超過1 年時間。王強等用電穿孔法將pGFP 質粒導入K562 白血病細胞中［3］，獲得90%以上的表達綠色熒光的細胞，穩定表達半年以上。錢鋒等通過電穿孔法使非貼壁細胞和難轉染細胞得到轉染［4］。

化學轉導

化學轉導主要包括陽離子脂質體和陽離子聚合物轉導。陽離子脂質體或陽離子聚合物通過細胞吞噬或吞飲作用將目的基因攜帶進入靶細胞中。

陽離子脂質體轉導:1987 年，自從Felgner 等首次發現脂質體可以轉移基因后［5］，大量被改良的陽離子脂質體用于轉移基因。在美國和歐洲，陽離子脂質體轉導外源的基因療法交付目前占正在進行的基因治療臨床試驗的9% ～12%［6］。劉志國等采用Lipofectine 轉染方法達到了外源基因在CHO 細胞中高效瞬時表達的目的［7］。

陽離子聚合物轉導的基因轉移:第一個被用于基因轉移的陽離子聚合物是多聚賴氨酸，此后越來越多的分枝狀或線狀的陽離子聚合物被用于外源基因轉導。其中主要包括人工合成的如聚甲基丙烯酸(PMA)、聚乙烯亞胺(PEI)等［8］。孫祥明等將PEI 攜帶DNA 質粒導入密度為1 ×107個/ml 細胞中［9］，轉染8 天后，在10．7L 培養液中收集到227mg 的EPO 蛋白。

病毒介導

將目的基因整合到特定的病毒中，通過病毒感染細胞，使目的基因轉導入細胞中。能夠進行轉導的病毒包括逆轉錄病毒、腺病毒、痘病毒和桿狀病毒。總的來說，病毒體系時間長代價高也比較復雜，操作不當還可能有潛在的危險。

結語

綜上所述，電穿孔法、陽離子脂質體法、陽離子聚合物法和病毒法因轉染效率高，成為近年來應用較多的哺乳動物細胞轉染方法。但每種方法也有其自身的局限性:電穿孔法細胞死率高;脂質體法在體內能夠引起免疫反應;陽離子聚合物法有某些細胞毒性;病毒法則需考慮轉染后的安全因素。只有選擇合適的方法，才有利于外源基因在宿主細胞中的高效表達。

1 Zhang G，Vargo D，Budker V，et al．Expression of naked plasmid DNA injected into the afferent and efferent vessels of rodent and dog livers［J］．Hum Gene Ther，1997(8):1763．

2 Molnar MJ，Gilbert R，Lu Y，et al．Factors influencing the efficacy，longevity，and safety of electroporation assisted plasmid based gene transfer into mouse muscles［J］．Mol Ther，2004(10):447．

3 王強，劉紅云，沈關心．綠色熒光蛋白白血病雞胚模型的構建［J］． 華中醫學雜志，2006(1):67．

4 錢鋒，肖成組．電擊緩沖液對哺乳動物細胞電穿孔效率的影響［J］．軍事醫學科學院院刊，1999，23(2):101-103．

5 Felgner PL，Gadek TR，Holm M，et al．Lipofection:a highly effi cient，lipid mediated DNA transfection procedure［J］． Proc Natl Acad Sci USA，1987(84):7413．

6 Alexander V Kabanov． Taking polycation gene delivery systems from in vitro to in vivo［J］．Today，1999，2(9):365-372．

7 劉志國，屈伸．DNA 高效轉染CHO 細胞的研究． 武漢工業學院學報，2002(1):4-6．

8 Boussif O，Lezoualch F，Zanta MA，et al．A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo:polyethylenimine［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1995(92):7297．

9 Xiangming Sun，Hui Ching Hia，Peen Ern Goh，Miranda G．S．Yap． Highdensity transient gene expression in suspension-adapted 293 EBNA1 cells［J］．Biotechnology and Bioengineering，2008，1(99):108-116．