通脈活絡膠囊的制備及對血栓性疾病治療的藥理作用實驗探討

陳艷紅

（山東省萊蕪市人民醫院 山東 萊蕪 271100）

近年來以冠脈血栓和腦血栓為主的血栓栓塞性疾病的發病率呈上升趨勢，靜脈血栓栓塞導致的死亡排在心腦血管疾病和惡性腫瘤之后的第三位，嚴重危害人類的健康。因此，尋求積極的預防及治療方法尤為重要，該研究通過做動物實驗的方法，觀察通脈活絡膠囊治療血栓性疾病的實驗數據，進一步探討其作用機理，為臨床應用提供安全、有效的方法，該研究的目的通過觀察通脈活絡膠囊的工藝制備，探討其質量控制標準，為臨床應用提供質量保證，以獲得治療血栓性疾病的藥理作用實驗數據。采用寒冷刺激加腎上腺素造成血瘀模型等方法，觀察通脈活絡膠囊的毒理、藥理的作用機制。研究如下：

1 制備工藝

1.1 處方組成：通脈活絡膠囊的藥物組成：僵蠶9g，水蛭9g，海風藤12g，陳皮12g，澤瀉9g，豬苓9g，續斷9g，澤蘭12g，牛膝9g，丹參12g，川芎12g，赤芍12g，紅花12g，桃仁10g。

1.2 制備工藝

1.2.1 制備方法：將以上中藥一十司味，如法炮制，烘干，配料、粉碎過100目篩，混勻，裝0號膠囊使每粒膠囊裝0.4g的藥粉，即得。

1.2.2 生產工藝流程：炮制→配料→烘干→粉碎→過100目篩→混勻→裝0號膠囊→包裝→檢驗→合格→入庫。

1.3 質量控制

［性狀］本品為膠囊劑，其內容物為淺黃色粉末、味苦。

［鑒別］取本品內容物粉末2g，加石油醚（60-90℃）10 ml，超聲處理30分鐘，濾過、濾液蒸干，殘渣加石油醚（60-90℃）1 ml使溶解，作為供試品溶液。另取赤芍對照藥材l g，同法制成對照藥材溶液。照薄層色譜法（附錄VIB）試驗，吸取上述兩種溶液各10ul，分別點于同一硅酸G薄層板上，以石油醚（60-90℃）一乙酸乙酯一醋酸（10：3：0.1）為展開劑，展開、取出、晾干，置紫外光燈（365n m）下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應的位置上顯相同顏色的斑點。

［含量測定］水蛭含量測定照高效液相色譜法（參閱中國藥典2005版附錄ⅥD）測定.色譜條件與系統適用性試驗：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇0.05 mol／L磷酸二氫鉀溶液一醋酸一異丙醇（67∶173∶4∶4）為流動相；檢測波長為230n m.理論板數按水蛭素峰計算應不低于1500.對照品溶液的制備：精密稱取在五氧化二磷減壓干燥器中干燥36小時的水蛭素對照品適量，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，搖勻，即得。供試品溶液的制備：取該品中粉約0.5g，精密稱定，置20 ml量瓶中，加甲醇約18 ml，浸泡4小時，超聲處理（功率150 W，頻率20k Hz）30分鐘，取出，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，取濾液，即得。測定法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μI，注入液相色譜儀，測定，即得。該品含水蛭素（C23 H28O11）不得少于0.80%.

［檢查］本品應符合膠囊劑項下有關的各項規定（參照《中國藥典》2005年版一部附錄IL）。

2 動物實驗藥理作用研究

2.1 實驗材料

2.1.1 藥品：通脈活絡膠囊（處方組成：僵蠶9g，水蛭9g，海風藤12g，陳皮12g，澤瀉9g，豬苓9g，續斷9g，澤蘭12g，牛膝9g，丹參12g，川芎12g，赤芍12g，紅花12g，桃仁10g）。將以上中藥按照配方配料，先行炮制、烘干、粉碎、過100目篩、混勻，取上述藥粉裝0號膠囊，使每粒膠囊裝藥粉0.4g即得。臨用前用蒸餾水配成不同濃度備用。

2.1.2 陽性對照藥：消栓通絡片，批號：20100601。

2.1.3 試劑：戊巴比妥鈉，國藥集團化學試劑有限公司，批號WS20080401；膠原蛋白，Sig ma，批號：9879；鹽酸腎上腺素.批號：0809301；冰醋酸，批號：08083l；氫氧化鈉，批號：2008228；活化部分凝血活酶（APTT）時間測定試劑盒，北京世堂帝科學儀器公司，批號：STG2020l-27；凝血活酶原（TT）時間測定試劑盒，北京世帝科學儀器公司，批號：STG10101-27；凝血酶（TT）時間測定試劑盒，北京世帝科學儀器公司，批號STG20802-19；血小板誘導劑（ADP），北京世帝科學儀器公司。

2.1.4 動物：二級昆明種小鼠，雄雌各半，體重1 8～22g；SD大鼠，雌雄各半，體重250～350g，均由市藥檢所實驗動物研究中心提供，生產合格征號：魯第2011-005號。

2.2 方法

2.2.1 通脈活絡膠囊對凝血功能的模型制備：60只小鼠隨機分為正常、陽性、消栓通0.25g／kg、0.50g／kg、1.00g／kg五組，每組12只，每天給藥1次，連續給藥14d，于末次給藥后1h，將小鼠尾尖1 c m處用利剪剪斷，它即秒表開始計時，至血液凝固為止即為出血時間［1］。血液自動流出.用濾紙吸去第1滴血后，將血滴于清潔載玻片兩端各1滴，立即秒表開始計時，用6號干燥針頭沿血滴邊緣向里輕輕挑動血滴，至針頭能挑起纖維蛋白絲為止.即為凝血時間。

2.2.2 通脈活絡膠囊對血瘀大鼠血小板聚集率及凝血因子的模型制備：60只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、陽性組、通脈活絡膠囊0.20g／kg、0.40g／kg、0.80g／kg六個劑量組，除正常對照組外，各組均造成血瘀模型。造模：參照文獻［2］復制血瘀模型，但鹽酸腎上腺素（Adr）的劑量及冰凍時間有所改變，具體操作如下：將1 mg／mL的Adr用生理鹽水稀釋1倍，第1d每隔4h皮下注射0.2 mL稀釋后的Adr，共給3次。在每2次給藥的中間時間將大鼠放入0～2℃冰水中4 min進行冷刺激；第2d仍按的日劑量給予2次Adr（間隔4h），在2次給藥的中間時間將大鼠放入冰水中3 min進行1次冷刺激，模型即造成。48h后大鼠1%戊巴比妥鈉（40 mg／kg）行腹腔麻醉，腹腔靜脈取血，置于3.8枸櫞酸鈉抗凝管中。離心，測定血小板聚集率和凝血因子［3］。

2.2.3 通脈活絡膠囊對膠原蛋白腎上腺素誘發小鼠體內血栓形成的模型制備：取小鼠60只，雌雄各半，隨機分成正常組、陽性組、通脈活絡膠囊0.25g／kg、0.50g／kg、1.00g／kg五組，給藥14d，各組于末次給藥后1h，每只小鼠尾靜脈注射膠原蛋白腎上腺素混合血栓誘導劑［4］。

3 結果

3.1 通脈活絡膠囊對凝血功能的影響比較：結果（見表1）顯示通脈活絡膠囊0.50g／kg、1.00g／kg給藥14d與正常對照組比較，有明顯延長小鼠凝血及出血時間的趨勢（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 通脈活絡膠囊小鼠凝血時間的影響(±s，n=12）

表1 通脈活絡膠囊小鼠凝血時間的影響(±s，n=12）

注：與對照組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01.

組別 n 劑量（g／kg） 出血時間（s） 凝血時間（s）正常組12 - 1150.58±40.52 127.75±65.92小劑量組 12 0.25 1225.00±38.00 171.80±67.51中劑量組 12 0.50 1528.70±40.15▲ 183.70±37.94△大劑量組 12 1.00 1550.00±44.38▲ 215.18±99.71△陽性組 12 1.00 1403.18±39.51△ 2.4.18±82.52△

3.2 通脈活絡膠囊對血瘀大鼠血小板聚集率及凝血因子的影響比較：結果（見表2～3）與正常組比較，模型組血液中TT、PT、APTT內源性和外源性凝血功能明顯縮短，血小板聚集率顯著增高；通脈活絡膠囊0.20g／kg、0.40g／kg、0.80g／kg均能明顯降低血瘀高凝大鼠模型Ⅱ因子活性，降低血小板聚集率，抑制內源性和外源性凝血系統，降低血液高凝狀態，與模型組比較有明顯差異（P＜0.05或P＜0.01）。

3.3 通脈活絡膠囊對膠原蛋白腎上腺素誘發小鼠體內血栓形成的影響比較 取小鼠60只，雌雄各半，隨機分成正常組、陽性組、通脈活絡膠囊0.25g／kg、0.50g／kg、1.00g／kg五組，給藥14d，各組于末次給藥后1h，每只小鼠尾靜脈注射膠原蛋白腎上腺素混合血栓誘導劑［5］，結果（見表4）表明通脈活絡膠囊0.50g／kg、1.00g／kg給藥1 4d與模型組比較，能明顯增加小鼠存活率（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 通脈活絡膠囊血瘀大鼠的血小板聚集率的影響(±s，n=10）

表2 通脈活絡膠囊血瘀大鼠的血小板聚集率的影響(±s，n=10）

注：與正常組比較，△P＜0.05，▲P＜0.01與模型組比較，◇P＜0.05，◆P＜0.01。

組別 n 劑量（g／kg） 血小板聚集率（%）正常組10 - 16.73±3.04模型組 10 - 27.36±4.68▲小劑量組 10 0.20 21.26±2.14△◇中劑量組 10 0.40 19.13±3.55▲大劑量組 10 0.80 18.55±3.20◆陽性組 10 0.80 23.24±2.82▲◇

表3 通脈活絡膠囊血瘀大鼠凝血因子的影響 （±s，n=10）

表3 通脈活絡膠囊血瘀大鼠凝血因子的影響 （±s，n=10）

組別 劑量 TT（s） PT（s） APTT（s）正常組- 30.06±2.78 15.21±1.90 36.84±3.91模型組 - 20.25±7.83▲ 7.40±0.35▲ 25.93±2.09▲小劑量組 0.20g／kg 28.05±5.19◇ 11.20±1.07◇ 30.81±3.39◇中劑量組 0.40g／kg 30.74±3.09◆ 14.76±1.33◆ 36.01±2.49◆大劑量組 0.80g／kg 29.30±2.68◆ 15.10±1.50◆ 37.25±1.34◆陽性組 0.80g／kg 27.16±3.38△◇ 17.38±1.77△◇ 35.00±2.32◆

表4 通脈活絡膠囊對小鼠體內血栓形成的影響（n=12）

4 討論

4.1 病因和發病機制：本病的病因及發病機制十分復雜，迄今尚未完全明確，但近年的研究表明血栓性疾病的發生、發展主要與下列6種因素有關：血管內皮損傷當血管內皮細胞因機械（如動脈粥樣硬化）、化學（如藥物）、生物（如內毒素）、免疫及血管自身病變等因素受損傷時，可促使血栓形成。其發病機制為：①內皮損傷、內皮細胞TF過度表達及釋放，外源性凝血途徑激活；②血管完整性破壞，FⅦ激活，內源性凝血途徑啟動；③血小板粘附、聚集、釋放反應增加；④內皮細胞受損，ET釋放，致血管收縮、血流受阻。血小板數量增加，活性增強各種導致血小板數量增加、活性增強的因素，均有誘發、促進血栓性疾病發生的可能性，如血小板增多癥、機械、化學、生物及免疫反應等導致的血小板破壞加速等。其致病機制與激活凝血反應等密切相關，詳見本篇第十五章。目前認為，血小板因素在動脈血栓形成（如心肌梗死）的發病中有更為重要的地位。血液凝固性增高在多種生理及病理狀態下，人體凝血活性可顯著增強，表現為某些凝血因子水平升高或活性增加，如妊娠、高齡及創傷感染等所致的應激反應、高脂血癥、惡性腫瘤等。而高凝狀態是血栓性疾病的發病基礎。抗凝活性減低人體生理性抗凝活性減低，是血栓形成的重要條件。引起人體抗激活性減低的常見原因有：①AT減少或缺乏；②PC及PS缺乏癥；③由FV等結構異常引起的抗蛋白C現象（APC-R），近年研究發現，在歐美白人反復發生深部靜脈血栓形成或有陽性家族史的深部靜脈血栓形成（DVT）患者中，APC-R的發生率高達60%；④肝素輔因子Ⅱ（HC-Ⅱ）缺乏癥等。纖溶活力降低臨床常見有：①纖溶酶原結構或功能異常，如異常纖溶酶原血癥等；②纖溶酶原激活劑（PA）釋放障礙；③纖溶酶活化劑抑制物過多。這些因素導致人體對纖維蛋白的清除能力下降，有利于血栓形成及擴大。血液流變學異常各種原因引起的血液粘滯度增高、紅細胞變形能力下降等，均可導致全身或局部血流淤滯、緩慢，為血栓形成創造條件。如高纖維蛋白原血癥、高脂血癥、脫水、紅細胞增多癥等。它可通過以下機制促進血栓形成：①紅細胞聚集成團，形成紅色血栓；②促進血小板與內皮的粘附及聚集，增強血小板活性；③損傷血管內皮，啟動凝血過程。

4.2 中醫藥理探討：現代醫學認為，與本病有關的因素有靜脈血流滯緩、靜脈壁損傷、血液的高凝狀態及妊娠分娩、肥胖、老年、心臟病、惡性腫瘤、口服避孕藥等。本病相當于中醫學的“股腫”，是由創傷、手術、妊娠、分娩、惡性腫瘤及因其它疾病而長期臥床，或長途乘車，以致久臥傷氣，血行緩慢，以致瘀血阻于脈中；或因飲食不節，素食膏粱厚味，濕熱內生，流注于血脈，濕熱與瘀血互結，阻于絡道所致。脈絡滯塞不通，不通則痛；營血回流受阻，水津外溢，聚而為濕，停滯于肌膚則腫；血瘀脈中，瘀久化熱，故患肢溫度升高。總之，絡脈血凝濕阻是本病的主要病機。針對這一病機，急性期在應用尿激酶溶栓抗凝的同時，以中醫通脈活血、利濕消腫為治療原則，自擬通脈活絡膠囊治療。方中桃仁、紅花、水蛭、赤芍、川芎、丹參活血化瘀通脈，其中川芎行血活血，走而不守；用澤蘭、取其行氣利水消腫、活血化瘀通脈的雙重功效，且行而不峻，祛瘀而不傷正，對肢體腫脹療效明顯；陳皮理氣行氣，使氣行則血行，血行脈自通；澤瀉、豬苓淡滲利濕消腫；牛膝引諸藥直達病所；僵蠶、海風藤祛風定驚，散結止痛；續斷有補肝腎、強筋骨、調血脈。諸藥合用，共達通脈活血、利濕消腫之目的。辨病和辨證相結合，以病為綱，病證合參，提高了療效，發病后能迅速控制病情，使靜脈再通，不遺留后遺癥或少留后遺癥，既縮短了病程，也降低了病殘率。

［1］中華人民共和國衛生部藥政管理局中藥新藥研究指南（藥學藥理學毒理學）：［M］.2004：172

［2］陳奇.中藥藥理研究方法學［M］.北京：人民衛生出版社，2004：564-566

［3］張強宗，劉俊田，史小蓮，等.水蛭免加熱提取物對高凝動物模型凝血系統及血小板聚集率的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2006。1 2（5）：47-49

［4］謝輝.許惠琴.李虹.韭白向提取物對小鼠凝血時間及體內血栓形成的影響［J］時珍國醫國藥.2004.1 5（1 2）：811-812

［5］陳領朝，連秀峰.袁秉祥，等.腦絡舒通膠囊對大鼠實驗性腦及動靜脈血栓形成的藥效與研究［J］.陜西中醫.2002，23（4）376-377