羊水干細胞對梗死心肌的修復作用

何凌宇，項 軍，梅 健，王 巖，王 磊，劉 成，薛 松

心肌發生缺血性梗死后，心肌細胞隨之出現壞死、凋亡等病理改變，造成有效細胞數目減少，由于成熟的心肌細胞本身已不再具有再生修復的能力，那么損傷及壞死的心肌細胞逐漸形成了纖維瘢痕，這樣的心室重塑只有導致有效的心室功能下降的趨勢，促使心力衰竭盡快發生［1］。近年隨著科技的進步，在心血管修復的再生治療學領域里有了突破性進展，心肌細胞成形術(cellular cardiomyoplasty，CCM)可以通過干細胞、祖細胞或心肌細胞移植，或者通過動員外周血或骨髓干細胞，重植于心肌損傷的部位，從而對梗死心肌進行再生修復［2－3］。CCM 成為有可能逆轉心肌梗死后惡化的血流動力學和神經內分泌的利器。各種動物實驗都證明了干細胞具有可再生心肌細胞、改善梗死心肌的血液灌注和心臟功能的生物學效應［4］。

目前，CCM 應用于臨床的主要有胚胎干細胞(ESCs)、骨髓來源的干細胞/祖細胞、脂肪組織來源的多潛能干細胞、宿主心肌干細胞(resident cardiac stem cells，CSCs)和間充質干細胞群 (Mesenchymal stem cells，MSCs)。而羊水干細胞(Amniotic fluid stem cell，AFS)由于組織來源廣泛、分離純化方法簡單易行、體外培養具有較強的增殖能力和多向分化潛能等優點，正逐漸被人們所認識，使其作為細胞心肌移植的良好供體，顯示出其巨大的潛力。

1 羊水來源干細胞是可靠的修復細胞來源

羊水中細胞成分眾多，目前對于這些細胞的起源了解有限，羊水中除有胎兒的表皮細胞、呼吸道上皮細胞、消化道和泌尿道等體腔管道的脫落細胞外，還含有來源于羊膜組織和3個胚層的細胞［5］。對孕期在7 ～12 周的羊水細胞組成分析，發現羊水中含有可能來源于胚胎卵黃囊的造血祖細胞，也是組織修復細胞之一。

Kocher 等［6］對人羊水細胞進行了分析，結合Kazuki 等［7］在人和鼠的AFS 中研究結果，分離出羊水中表達Esc 和Asc 表面標志的細胞，并以此估計AFS 數量上約占羊水細胞總數的1%。他們認為這種干細胞多潛能性介于胚胎干細胞與成體干細胞之間。

2 AFS 生物學特性

2.1 AFS 的標志性抗原 目前尚未發現人AFS 所特有的表面標志性抗原，但對人AFS 的表面標志的鑒定，基本取得了共識，AFS 表面表達CD29、CD44、CD105、CD73 黏附因子和間充質的標志，不表達CD34、CD45 等造血干祖細胞標志及內皮標志Cn31，胚胎性抗原中SSEA－4、Oet－4 陽性，而SSEA －3、Tra－l－61、Tra －l －80 為陰性。人類白細胞抗原HLA －DR 陰性，而Ⅰ類白細胞抗原HLA－A、B、C 陽性。但是各個研究組對這些標志性抗原所測定的數量差異較大，造成這種現象的原因可能是缺乏統一的AFS 的純化標準以及檢測方法的差異性等各個方面造成，同時這也表明羊水中可能存在表達抗原差異的干細胞群的存在［8］。

特別是Oct－4、Nanog、SSEA －4 等胚胎特異性標志抗原的表達，Oct－4、Nanog 是維持干細胞分化潛能的主要轉錄因子，干細胞分化后該基因的表達馬上下調或消失，這在最近對再生修復基因重組方面的研究中得到明確。特異性抗原SsEA－3/ssEA－4 抗原來自小鼠移植前胚胎及人類胚胎細胞，而且這些表達僅限于移植前的胚胎細胞表面［9］。因此可以說明，AFS 可能來源于非常原始的細胞群落，比成體干細胞具有更廣泛的自我更新和多種系分化的能力。

2.2 AFS 的多向分化能力 2011 年Li 等［10］最早報道了從人孕早期羊水中分離并擴增的干細胞，于體外將其誘導為脂肪樣細胞及成骨樣細胞，隨后AFS 向神經元、軟骨細胞、心肌細胞、內皮細胞、平滑肌細胞、肝細胞等誘導的報道不斷出現，誘導體系與其他來源的間充質干細胞相似度較高。Muller等［11］從孕4 ～6 個月人的羊水中分離培養獲得的多能間充質干細胞，在誘導因子作用下能夠向多種細胞分化，這些包含了:使用地塞米松、胰島素等誘導其分化為脂肪細胞;使用地塞米松、維生素C－2 －磷酸鹽可以誘導其分化為成骨細胞;成纖維細胞生長因子和p －琉基乙醇等誘導其分化為神經系細胞，之后并證實了分化后的神經系細胞能夠分泌釋放多巴胺。Zhao等［12］對羊水成纖維細胞型細胞進行培養，于第3 代獲得與BMSCs 相似，形態學上同源于成纖維細胞樣的細胞群。

在適當的培養條件下，AFS 分化至第8 代可分化為脂肪細胞、骨細胞、多形態軟骨細胞和神經元;第5 ～21 代，由于細胞端粒酶活性水平的不斷降低，成骨蛋白、甲胎蛋白、Nestin和肝細胞核因子在體外擴增時顯示出差異性表達是比較明顯的。有關AFS 的分化潛能，有幾個值得注意的現象。國內學者馬曉榮等［13］發現人羊水來源干細胞以類胚體樣結構形式向心肌樣細胞分化的可行性，為AFS 在再生醫學的研究做出了較大貢獻。

3 AFS 在組織工程學的廣泛應用

羊水來源的干細胞為組織工程提供了一個新的種子細胞來源。Orlic 等［14］將體外培養獲得的羊水細胞處理后，種植于可降解的生物材料PGA 支架上，發現隨著細胞不斷生長，密集度的增加，逐漸能填滿PGA 纖維孔隙。羊水來源的胎羊間充質干細胞也被成功地應用于構建組織工程，隔肌進而修復新生的隔肌，并取得了良好的效果。Wang 等［15］將AFS 處理后嵌入藻酸鹽做支架的工程上，此細胞/支架結構在骨原性誘導培養基中，培養后植入免疫缺陷鼠皮下后成功形成組織工程骨組織。AFS 在醫學多學科再生方向中取得了長足進展。

2010 年Valli 等［16］研究中將羊水來源間充質干細胞，處理后能夠移植入正常鼠大腦的多個區域并長期保持存活，而且發現在注入腦缺血的模型鼠的腦缺血區外圍時具有向損傷區域分化、遷移的能力。AFS 分化后的細胞也能夠表現出特定的再生功能，神經元可分泌各種神經遞質樣物質，分化的肝細胞可產生尿素樣物質，將標記綠色熒光蛋白的AFS 通過顯微注射技術注射到孕12d 左右小鼠胚胎腎臟皮質內，通過活體顯微觀察，原為雜交等技術證實注射的AFS 可整合到原始腎臟細胞群體中并進一步分化、生長［17－22］。

4 展望

干細胞研究是21 世紀再生醫學的研究熱點之一，AFS 可為組織工程學研究提供新的種子細胞來源，隨著深入研究AFS的分化機制及實驗方向的開展，建立和完善AFS 的體外培養體系，對梗死心肌的再生醫學研究具有重大意義。

1 Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，et al． Bone Marrow cells regenerate infracted myocardium ［J］． Nature，2001，410:701 －705．

2 Zhang S，Geng H，Xie H，et al． The heterogeneity of cell subtypes from a primary culture of human amniotic fluid ［J］． Cell Mol Biol Lett，2010，15:424 －439．

3 Guo SZ，Wang NF，Zhou L，et al． Influence of granulocyte colony －stimulating factor on cardiac function in patients with acute myocardial infarction and leukopenia after revascularization ［J］． Chin Med J，2010，123:1827 －1832．

4 劉維新，宋健，萬喻，等. 體外“心肌樣”環境誘導骨髓基質細胞向心肌細胞分化［J］ . 武漢大學學報 (醫學版)，2004，25(2):101 －103，107．

5 Askari AT，Unzek S，Popovic ZB，et al． Effect of stromal－cell－derived factor1 on stem－cell homing and tissue regeneration in ischaemic cardiomyopathy ［J］． The Lancet，2003，362:697 －703．

6 Kocher AA，Schuster MD，Szabolcs MJ，et al． Neovascularization of ischemic myocardium by human bone－marrow－derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis，reduces remodeling and improves cardiac function ［J］． Nat Med，2001，7:430 －436．

7 Kazuki Y，Hiratsuka M，Takiguchi M，et al． Complete genetic correction of ips cells from Duchenne muscular dystrophy ［J］． Mol Ther，2010，18:386 －393．

8 Stefanidis K，Loutradis D，Anastasiadou V，et al． Bidirectional communication between neural and cardiac cells in human amniotic fluid［J］． Fetal Diagn Ther，2009，25:62 －66．

9 Rangappa S，Entwistle JW，Wechsler AS，et al． Cardiomyocyte－mediated contact programs human mesenchymal stem cells to express cardiogenic phenotype ［J］． J Thorac Cardiovasc Surg，2003，126 (1):124 －132．

10 Li TS，Cheng K，Malliaras K，et al． Expansion of human cardiac stem cells in physiological oxygen improves cell production efficiency and potency for myocardial repair ［J］． Cardiovasc Res，2011，89:157 －165．

11 Muller P，Pfeiffer P，Koglin J，et al． Cardiomyocytes of noncardiac origin in myocardial biopsies of human transplanted hearts ［J］． Circulation，2002，106 (1):31 －35．

12 Zhao P，Ise H，Hongo M，et al． Human amniotic mesenchymal cells have some characteristics of cardiomyocytes ［J］． Transplantation，2005，79:528 －535．

13 馬曉榮，謝華，張勝利，等. 人羊水來源干細胞以類胚體樣結構形式向心肌樣細胞分化的可行性［J］. 中華醫學雜志，2011，91(46):3293 －3297．

14 Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，et al． Bone marrow cells regenerate infracted myocardium ［J］． Nature，2001，410:701 －705．

15 Wang JS，Shum－Tim D，Galipeau J，et al． Marrow stromal cells for cellular cardiomyoplasty:feasibility and potential clinical advantages［J］． Thorac Cardiovasc Surg，2000，120:999 －1005．

16 Valli A，Rosner M，Fuchs C，et al． Embryoid body formation of human anniotic fluid stem cells depends on mTOR ［J］． Oncogene，2010，29:966 －970．

17 Hakuno D，Fukuda K，Makino S，et al． Bone marrow derived regenerated cardiomyocytes(CMGCells)express functional adrener and muscarinic receptors ［J］． Circulation，2002，105:380 －386．

18 Yeh YC，Wei HJ，Lee WY，et al． Cellular cardiomyoplasty with human amniotic fluid stem cells:in vitro and in vivo studies ［J］． Tissue Eng Part A，2010，16 (6):1925 －1936．

19 郝嘉，游凱，肖穎彬，等. 羊水干細胞的研究現狀［J］. 中國胸心血管外科臨床雜志，2010，17 (5):399 －403．

20 王建安，謝小潔，何紅，等. 羊水來源干細胞與心肌組織再生性治療的研究進展［J］. 中華心血管病雜志，2006，34 (2):107－110．

21 Benchaouir R，Meregalli M，Farini A，et al． Restoration of human dystrophin following transplantation of exon － skipping － engineered DMD patient stem cells into dystrophic mice ［J］． Med Sci，2008，24:99 －101．

22 Zhang P，Baxter J，Vined K，et al． Endothelial differentiation of amniotic fluid － derived stem cells:synergism of biochemical and shear force stimuli ［J］． Stem Cells Dev，2009，18:1299 －1308．