酶反應提取技術在中藥化學成分提取中的應用

王忠雷 楊麗燕 曾祥偉 李朋收 張小華

(1北京中醫藥大學中藥學院，北京，100102;2中國石油大學(北京)理學院;3北京豐泰金源藥業有限公司)

隨著中藥研究與開發現代化的進程，經典的提取方法如溶劑提取法、水蒸氣蒸餾法、壓榨法及升華法等因有效成分提取率不高、雜質清除率低等弊端，已經難以滿足社會發展的需求。而一些新型、高效的提取新技術、新方法，已在近年的中藥研究中陸續顯現出各自的優勢。筆者僅以酶反應提取技術為例，論述其在中藥化學成分提取中的應用進展及方法特點，以期中藥提取新技術能夠更加合理有效地應用于中藥研發過程［1］。

1 酶的古代應用及酶提取技術的形成

一方面，人類在生產活動中有目的地利用生物酶已有幾千年歷史，例如釀酒、制作飴糖、制醬等。從龍山文化遺存的大量陶制貯酒可以推知，遠在5000年前，我們祖先已開始人工釀酒了;早在3000多年前國人已應用微生物發酵方法進行麻纖維的漚漬脫膠;另外，在1000多年前的《齊民要術》中已有用“魚醬汁”來調味的論述。但由于歷史原因和科技的限制，當時的人們沒有意識到、也不可能意識到這是“酶”在起作用［2］。

另一方面，酶反應提取技術真正形成則源于近代。酶化學是從1814年，Kirchhoff發現淀粉酶以后開始的。1926年，Sumner首次得到尿酶結晶以及Northorp對蛋白水解酶的研究，逐步建立酶化學的基礎。20世紀50年代中期，多學科的互相滲透使酶化學迅速發展。人們通過對氨基酸排列結構，酶的生物催化活性本質以及酶的專一性等的研究，使生物酶的應用逐步發展成為制藥工業的重要手段之一。然而酶法在中藥提取中的應用到20世紀90年代才陸續見報。21世紀以來，酶反應提取技術在中藥化學成分提取中的應用日益普遍，并取得了較好的效果［3］。

2 酶反應提取技術的原理及特點

植物類藥材約占中藥總量的90%，其活性成分主要存在于植物細胞壁內。因此，細胞壁的多糖類物質所構成的致密結構自然成為了中藥有效成分提取的主要屏障。而酶反應提取技術，即向待提取的中藥液中加入某些特定的酶，通過破壞構成細胞壁的纖維素的基本單元的β－葡萄糖苷鍵等，導致細胞壁等處的纖維素、果膠等物質降解，從而使其致密性降低，以減少細胞原生質中的有效成分向溶媒擴散時細胞壁及細胞間質的阻力，進而有利于有效成分的提取。以上內容即為酶反應提取技術的基本原理。

酶反應提取技術在中藥有效成分提取中得到越來越廣泛的應用源于其如下特點:在較溫和的條件下提取，提取產物活性較高，穩定性較好。但是，酶反應提取技術同時受到最佳反應溫度、pH值、酶及底物濃度、抑制劑和激動劑對提取物的影響等條件的制約［4］。

3 酶提取技術在中藥中的應用

中藥品種繁多，有效成分的類型差異較大，因此需要按實際情況選擇不同種類的酶來提取。常用的酶反應提取方法有復合酶法、纖維素酶法、果膠酶、超聲酶法及轉苷酶法等。

3.1 纖維素酶法 植物細胞壁主要成分是纖維素，干燥植物體中纖維素占1/3～1/2，是形成植物細胞壁的框架。纖維素是β－葡萄糖以β－1，4－糖苷鍵連成的直鏈分子，而纖維素酶可降解β－1，4－糖苷鍵從而破壞植物細胞壁［5］。韓偉等［6］采用纖維素酶、果膠酶、蛋白酶等酶法提取積雪草中的積雪草苷，結合正交試驗，結果發現，在纖維素酶與底物積雪草質量比m(E)∶m(S)=1∶50的時候，具有較理想的提取率。與傳統提取方法相比，酶法提取速率快，工藝條件溫和，得率高，是一種良好的提取方法。馬桔云等［7］在從中藥飲片中提取穿心蓮內酯之前，先對原藥材飲片進行纖維素酶解處理以破壞β－葡萄糖苷鍵，其他條件與原工藝相同，結果發現穿心蓮內酯的含量和提取量均較原提取工藝高，且對所提取有效成分沒有影響，并考慮將它用于穿心蓮提取的工業化生產中。李永生等［8］通過比較纖維素酶、半仿生、乙醇回流提取方法對川烏中烏頭堿、烏頭總堿的影響，篩選最佳方法，利用纖維素酶輔助提取川烏生物堿，以烏頭堿、烏頭總堿提取率為指標，正交試驗優化纖維素酶的最佳提取條件，再與半仿生、乙醇提取方法進行比較。實驗證明，酶用量8mg/g時烏頭堿提取率高達0.002 447%，烏頭總堿提取率高達0.244 410%，而半仿生提取烏頭堿、烏頭總堿的提取率分別為0.001 735%、0.189 340%，乙醇回流提取烏頭堿、烏頭總堿提取率分別為0.001 869%、0.200 720%，可知纖維素酶提取法具有明顯的優勢。張華芳［9］等研究表明，用纖維素酶法提取羊棲菜多糖，以褐藻膠得率和羊棲菜粗多糖為定量指標，采用正交設計優選酶法提取條件，所得的多糖的質量分數為4.89%，較水提醇沉法、堿提醇沉法等有顯著提高。

3.2 果膠酶 果膠酶由黑曲霉發酵所得，是分解果膠復合物的酶的總稱，可分為果膠甲酯酶和多聚半乳糖醛酸酶。藍峻峰等［10］通過添加果膠酶提取葉下珠有效成分，以沒食子酸提取率為考察指標，用高效液相色譜法測其含量，利用正交試驗設計優選其提取工藝，結果發現，在果膠酶濃度為1.5g/L時，葉下珠沒食子酸的平均提取率高達1.053%。因該工藝條件在較低的溫度下、較短的時間內可較大程度提高葉下珠有效成分提取效率，故而有效地降低了提取能耗，而且提取過程中不使用有機溶劑，對環境友好，易于實現綠色工業化生產。李玲等［11］研究采用果膠酶提取川芎多糖的最佳工藝條件，方法為采用單因素實驗和正交設計進行優選，考察酶用量、pH、反應時間和反應溫度對川芎多糖提取的影響。結果發現，在果膠酶用量為1%條件下，川芎多糖的平均得率高達11.3%。

3.3 復合酶法 復合酶法因其操作簡單、高效、穩定等優點近幾年已被廣泛應用在中藥活性成分的提取中。劉穎新等［12］以毛脈酸模的根為原料，采用復合酶提取，通過正交試驗優選條件，實驗表明，在所用酶量為3%時對其有效成分有較理想的提取。王穎莉等［13］研究酶法結合傳統回流法提取遠志總皂普工藝條件，利用可見分光光度法測定遠志總皂苷含量，考察植物復合酶的酶解時間、酶解溫度對傳統提取工藝的強化效果，通過顯微結構圖和紅外光譜圖說明了復合酶法強化傳統提取法的作用方式及提取物的結構。結果表明酶用量為0.4%時，可提高遠志總皂普提取率、縮短提取時間、減少乙醇使用量，這對于遠志流浸膏的高效提取具有一定指導意義。另外，劉國際等［14］以復合酶法提取薯蕷皂苷元，結果發現，復合酶法較其他酶法具有一定優勢。且本實驗所選用的酶為粗制品，價格廉價，有助于薯蕷皂苷元大規?；a。張明春等［15］以水提工藝為對照，研究了纖維素酶與果膠酶復合酶法提取酸棗仁黃酮新工藝。結果發現，在纖維素酶與果膠酶比為1∶1.30U/g酸棗仁時提取。該工藝的酸棗仁黃酮提取率比傳統水提工藝提高了54.67%。張明［16］以山東大青葉為材料，以復合酶水解、乙醇沉淀法提取其中的多糖。通過正交試驗，結果發現在纖維素酶1.5%、果膠酶2.0%、胰蛋白酶1.5%的條件下大青葉多糖的平均得率可高達18.24%。

3.4 轉苷酶法 轉苷酶是葡萄糖苷轉移酶的簡稱，轉苷酶法在中藥提取與啤酒發酵等已有應用并顯示了明顯的優勢。許明淑等［17］以銀杏葉為原料，利用 Suhong475轉苷酶將黃酮苷元轉為黃酮苷以提高其水溶性，再以低濃度的乙醇溶液提取，結果表明，總黃酮的提取率比未加酶的對照組增加了44%。其實，早在上世紀90年代，日本學者高根芳春就已采用轉苷酶對黃酮苷元進行提取，通過糖基轉移獲得了更高活性、更便于人體吸收利用的銀杏葉的有效成分槲皮素苷，使其黃酮提取率從原先的0.22%提升為0.38%。另外，轉苷酶法還有更廣泛的應用，如李峰等［18］用跳躍式糖化與加轉苷酶相結合的方法，生產出了更加優質的低醇啤酒。

3.5 超聲―酶法 賁永光等［19］以黃芪飲片為原料，結合單因素實驗，采用超聲―酶法提取黃芪總多糖，并通過正交試驗優化其提取工藝。結果發現，在超聲提取時間30min、酶量10mg等條件下，黃芪多糖的提取率為24.2%，較傳統水提工藝有明顯提高。陶濤等［20］以九華山黃精為原料，水為提取溶劑，采用超聲波協同纖維素酶方法對其多糖和皂苷進行綜合提取。通過單因素和正交試驗研究，結果發現，在纖維素酶與底物質量比為1%時，多糖和皂苷提取率分別是39.36%和11.69%。相比傳統提取方法，多糖和皂苷的提取率均有了提高。另外，徐艷等［21］研究超聲―酶法在黃柏的小檗堿提取中的應用效果，同樣采用單因素實驗和正交實驗，結果發現在超聲功率為80%、加酶25mL時黃柏小檗堿的提取率高，且具有高效、節能等優勢。周琳等［22］研究報道了超聲―酶法提取三七總皂苷，以三七提取液中總皂苷的含量和提取物得率為指標，并采用四因素、三水平正交設計法，結果發現在纖維素酶與果膠酶用量比為3∶28時，三七提取液中總皂苷得率高達35.17%。

4 結語

隨著現代科學的迅猛發展與中藥現代化步伐的加快，酶反應提取技術因其高效節能、方法簡便等優勢而在中藥提取中的應用日益頻繁。雖然目前該方法在實驗條件及酶種類等方面存在一定的局限性，但隨著技術的不斷進步，相信該方法將在中藥的提取方面展示更加廣泛的應用前景。

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