羊乳中摻入牛乳檢測(cè)方法的研究

■周慕萍 黑龍江完達(dá)山哈爾濱乳品有限公司密山分公司

乳品摻假現(xiàn)象的發(fā)生已經(jīng)對(duì)消費(fèi)者的健康與安全形成危害，造成公共衛(wèi)生問題。本研究通過免疫學(xué)檢測(cè)羊乳中摻入牛乳含量的研究，優(yōu)化了間接ELISA的檢測(cè)條件：包被脫脂牛乳、牛乳酪蛋白以及滅菌乳稀釋倍數(shù)1：128，l：32，1：128：分別加入經(jīng)抗體修飾技術(shù)處理后的抗體，稀釋度分別為：l：160，1：80，1：160，建立了檢測(cè)羊乳樣品中摻入牛乳成分含量的間接ELISA方法。

一、引言

牛乳與羊乳構(gòu)成世界乳品市場(chǎng)的主要部分。羊乳及其制品由于營(yíng)養(yǎng)豐富，更易于胃部吸收，風(fēng)味獨(dú)特，受到中外客商高端消費(fèi)者的歡迎。但是，相對(duì)于奶牛，奶山羊生長(zhǎng)緩慢，泌乳期短，冬季羊乳更是點(diǎn)滴無收。這導(dǎo)致羊乳產(chǎn)量非常有限，也給羊乳制品企業(yè)的原料采購造成巨大困難。羊乳因?yàn)槭艿郊竟?jié)波動(dòng)性等影響價(jià)格偏貴。由于市場(chǎng)價(jià)格成本及原料控制及生產(chǎn)的諸多原因，便有不法分子在經(jīng)濟(jì)考量下昧著商業(yè)道德將牛乳摻入羊乳中魚目混珠來降低成本，侵害消費(fèi)者權(quán)益，違反商品標(biāo)簽法、消費(fèi)者保護(hù)法及公平交易法。另一方面，也可能導(dǎo)致對(duì)牛乳過敏者在不知的情況下誤食，而發(fā)生過敏反應(yīng)，危害消費(fèi)者健康與安全，造成公共衛(wèi)生問題。

1.研究目的和意義

我國的乳品工業(yè)發(fā)展很快，原料基地分散、養(yǎng)殖規(guī)模小、且很不穩(wěn)定，養(yǎng)殖從業(yè)人員的業(yè)務(wù)素質(zhì)及職業(yè)道德有待提高。此外，由于利益的驅(qū)動(dòng)，原料乳摻雜使假現(xiàn)象非常嚴(yán)重，從單純的兌水、加入水解植物蛋白和淀粉類物質(zhì)或增稠劑轉(zhuǎn)向多重?fù)郊伲瑩郊偌夹g(shù)不斷“高明”，足能以假亂真。原料乳中摻入雜質(zhì)，不僅會(huì)使牛乳和相應(yīng)品質(zhì)量降低，而且會(huì)給生產(chǎn)過程帶來很大的困難，造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，甚至?xí)劤芍卮蟮纳a(chǎn)事故；因食奶粉中毒事件時(shí)有發(fā)生，直接危害到消費(fèi)者的健康和嬰幼兒的生命安全。另一方面，由于羊乳生產(chǎn)乳源產(chǎn)量小、高度分散的特殊性，使得生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)純的羊乳粉從源頭陷入難以控制的困境，這是由于傳統(tǒng)針對(duì)牛乳原料摻假及品質(zhì)檢驗(yàn)的方法與設(shè)備不適應(yīng)于羊乳檢驗(yàn)，況且羊乳中摻入一定量的牛乳從感官及傳統(tǒng)常規(guī)指標(biāo)上都難以檢出，現(xiàn)場(chǎng)使用高精尖儀器設(shè)備（色譜儀，毛細(xì)管電泳儀等）也不可能，從生產(chǎn)企業(yè)保證生產(chǎn)到保護(hù)消費(fèi)者的利益各個(gè)方面考慮都急需相應(yīng)的檢測(cè)方法。目前，針對(duì)牛乳中的源物質(zhì)（如淀粉，糊精，脂肪，明膠粉，糖，水等）摻假檢驗(yàn)國內(nèi)外報(bào)道很多，也有許多成熟方法，開發(fā)了相應(yīng)的設(shè)備儀器，但是對(duì)羊乳及其制品（乳酪等）中摻入牛乳成分等乳源性的檢驗(yàn)國內(nèi)很少報(bào)道，這與傳統(tǒng)摻假檢驗(yàn)和一般成熟的品質(zhì)量分析是截然不同的新問題，很值得研究。

2.羊乳與牛乳的營(yíng)養(yǎng)組成及生產(chǎn)現(xiàn)狀

羊乳的總營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高于牛乳，其中干物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)含量一般比牛乳高10%左右，羊乳中除乳糖外，蛋白質(zhì)、脂肪、固形物等含量均高于牛乳。羊乳中維生素A、硫胺素、核黃素、尼克酸、泛酸、維生素B6、葉酸、生物素、維生素B12和維生素C等10種主要維生素的總含量比牛乳高；特別是維生素C的含量是牛奶的10倍；尼克酸含量是牛奶的2.5倍；維生素D的含量也比牛乳高。山羊乳含有多種礦物質(zhì)，其含量遠(yuǎn)高于人乳，也高于牛乳。特別是鈣和磷，不僅含量高，而且比例適當(dāng)，對(duì)老人、青少年、嬰幼兒、孕婦和哺乳期的婦女特別重要。羊乳pH7.0左右，具有抗變態(tài)反應(yīng)的特性。而牛乳略偏酸性，pH6.6～6.8。所以對(duì)于胃酸分泌過多的人及胃潰瘍患者，羊乳是一種有治療作用的飲品。羊乳含脂量高，每100mL羊乳中含脂肪為4g。羊乳脂肪以脂肪球的形式或存在于乳中，脂肪球小而均勻，直徑為2微米左右，豐富的中鏈脂肪酸不會(huì)造成脂肪的堆積，溶解快，食后在腸胃中保持液態(tài)，而牛乳的脂肪球在3--4微米左右。與牛乳相比，羊乳中的短鏈脂肪酸（C4～C12）的含量稍高，其中C10的含量高許多。

二、方法

為建立間接ELISA檢測(cè)乳品摻假，需要先對(duì)間接ELISA檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)優(yōu)化條件建立檢測(cè)方法，并且對(duì)檢測(cè)方法做方法學(xué)鑒定。

1.間接ELISA方法的建立

間接ELISA法是先將待測(cè)抗原固相化，然后加入抗體，最后利用酶標(biāo)記的抗抗體（酶標(biāo)二抗）反應(yīng)顯示結(jié)果。

主要的實(shí)驗(yàn)部分：①包被：用0.05M pH 9.6包被緩沖液將待測(cè)樣品適當(dāng)稀釋包被酶標(biāo)板，100μl/孔，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，用PBST洗板3次，每次3分鐘。（簡(jiǎn)稱洗滌，下同）。②封閉：每孔加入100μl 0.1%明膠在37℃下，溫育1h，洗滌。③加抗體：加一定稀釋的抗體100μl/孔，置37℃孵育2h。然后洗滌。（同時(shí)做空白孔、陰性對(duì)照）。④加酶標(biāo)抗體：加100μl/孔體積比為1：1000稀釋的酶標(biāo)羊抗兔培IgG，37℃孵育1h，洗滌5次；⑤加底物顯色：加入臨時(shí)配制的底物緩沖液（TMB+H202）100pt/孔，室溫下避光孵育15--20分鐘。⑥終止反應(yīng)：用濃度為2mol/L的硫酸終止反應(yīng)，50μl/孔；⑦檢測(cè)：用酶聯(lián)免疫測(cè)定儀，以空白孔為對(duì)照，波長(zhǎng)為450nm時(shí)各孔吸收A值。間接ELISA法的建立，應(yīng)對(duì)包被抗原的濃度、抗體以及酶標(biāo)抗體的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)確定，以達(dá)到最佳測(cè)定條件。實(shí)驗(yàn)中研究的包被抗原有兩種，一是牛β-酪蛋白（作為后續(xù)檢測(cè)方法的基礎(chǔ)），另一種以羊乳為基質(zhì)添加不同量的牛乳（其中的檢測(cè)目標(biāo)物質(zhì)也是牛β-酪蛋白）。

2.間接ELISA檢測(cè)牛β-酪蛋白的結(jié)果

利用先前制備的血清抗體可以特異地檢測(cè)牛乳β-酪蛋白，以有效地針對(duì)乳中摻入其他雜蛋白的摻假檢測(cè)。

3.脫脂羊乳摻假檢測(cè)的間接ELISA建立

將脫脂牛乳按梯度0、2、5、10、20、30、40、50、70、100%（v/v）摻入脫脂羊乳中作為待檢樣品。樣品的最佳包被濃度為1：128，blocked anti-BC稀釋度為1：80，酶標(biāo)二抗稀釋度為1：1000，建立間接ELISA試驗(yàn)。各個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣都設(shè)立三個(gè)平行孔，求出它們吸光值的均值。

三、結(jié)論

本章建立了牛β-酪蛋白的間接ELISA測(cè)定方法以及羊乳中摻入牛乳檢驗(yàn)的間接ELISA方法。兩種方法都是針對(duì)牛乳中的β-酪蛋白為檢測(cè)目標(biāo)，檢測(cè)目的以及建立ELISA所需要的抗原，抗體是不同的。前者是以β-酪蛋白為包被抗原，利用制備的兔抗牛β-酪蛋白血清抗體（anti-BC）建立間接ELISA方法。牛β-酪蛋白檢測(cè)的線性范圍是25-2500ng/mL，變異系數(shù)（CV）小于5%，回收率在93.5%--127%；檢測(cè)牛β-酪蛋白方法的重復(fù)性和準(zhǔn)確度能滿足檢測(cè)要求，并且方便易行，可以通過β-酪蛋白與牛乳中總蛋白質(zhì)的關(guān)系，用于牛乳及其產(chǎn)品的牛乳源性蛋白質(zhì)的快速免疫方法檢測(cè)，作為質(zhì)量控制的重要指標(biāo)。

四、展望

國際乳品行業(yè)普遍認(rèn)為，羊乳中加入牛乳是一種摻假行為。本研究應(yīng)實(shí)際檢測(cè)需要，結(jié)合國內(nèi)外先進(jìn)的抗體制備及特異性檢測(cè)方法，將特異性抗體運(yùn)用于靈敏可靠的免疫學(xué)（ELISA）檢測(cè)中，建立了間接ELISA快速檢測(cè)方法，初步鑒定了其可靠性和特異性，靈敏度也不低于國內(nèi)外同類方法，對(duì)羊乳乳品中摻入牛乳成分提供了新的檢測(cè)途徑，為乳品質(zhì)量提供保障。

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