響應面法優化皖南山核桃殼棕色素的提取工藝

劉建平，王淑怡，吳麗麗

（華東交通大學基礎科學學院，江西南昌330013）

天然色素對人類安全無毒害，可作為醫藥、化妝品、食品等行業中的理想添加劑[1-3]。目前，天然色素的主要來源是從植物中提取分離得到，其中天然棕色素主要來自核桃殼[4]、板栗殼[5]、油茶果殼[6]、榛子殼[7]、竹筍殼[8]等植物中。山核桃殼是山核桃的外果皮，堿性較強，既不能作飼料也不能直接作肥料，被丟棄后既浪費資源又污染環境[[9-10]。目前，產自我國新疆[11]，東北[12]、云南[13]等地區的核桃殼色素的研究工作已經見諸報道。位于皖南山區的寧國市，素有“中國山核桃之鄉”的美譽，此地所產的山核桃，不同于我國其它地區的大核桃，屬于稀特產品。據統計，2012年此地區的山核桃產量約有9 000 t，按每噸果實含三分之一果殼估算，將會產生約3 000 t廢棄的果殼，如果不加以綜合利用，將會給該地區帶來嚴重的環境污染。凌慶枝等[14]研究了寧國山核桃外果皮色素的各種性質，其提取方法為普通的水溶液浸提，也沒有探討并優化提取工藝。試驗采用超聲波輔助浸提技術，根據響應面分析法中的Box-Behnken[15]試驗原理建立數學模型，分析指標和因素間的非線性關系，從而優化山核桃殼中棕色素的提取工藝，為寧國山核桃殼棕色素的提取和應用提供更進一步的理論基礎和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃殼：產自安徽寧國山區，冷凍8個月后取出自然風干。干燥至恒重，粉碎至60目。實驗所用試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

DHG-9101電熱恒溫鼓風干燥箱，上海光都儀器設備有限公司；KQ-100KDB數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；AB204-N電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試驗流程

提取工藝流程：山核桃殼→風干→粉碎→干燥至恒重→超聲輔助提取→過濾→濾液→醇沉→離心→取膠狀沉淀→真空干燥→產品。按下式計算提取率Y

式中：M 為核桃殼質量，g；m為核桃殼棕色素產物質量，g。

1.3.2 單因素試驗

以液料比、提取時間和提取溫度作為影響棕色素提取率的單因素條件。

1.3.3 棕色素提取工藝的響應面優化

在單因素實驗的基礎上，采用Box-Behnken模型，以棕色素提取率為響應值，以液料比、提取溫度和提取時間為自變量，通過響應面法優化山核桃殼中棕色素的提取工藝，試驗因素水平設計如表1所示。

表1 響應面優化試驗因素與水平Tab.1 Factors and levels of the RSM experiments

表1按方程 Xi=(xi-x0)/Δx對自變量進行編碼。其中：Xi為自變量的編碼值，xi為試驗因素，i=1，2，3；x0為實驗中心點處自變量的真實值；Δx為自變量的步長。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 液料比

從圖1可以看出，棕色素提取率隨液料比的增加而增加，這是因為液料比的增加，棕色素越容易溶出。尤其是在液料比為15 mL·g-1之前，提取率增加較為明顯。超過此值后，隨液料比的增加，棕色素提取率增加趨緩，這可能是因為能溶出的棕色素量基本都已溶出，因此，再增加液料比對增加棕色素提取率影響不大。當液料比為25 mL·g-1時，提取率出現翹尾的原因可能是溶劑量的增加導致的低極性雜質和水溶性雜質的溶出。因此，最終確定15 mL·g-1為優化實驗中液料比的中心值。

2.1.2 提取溫度

從圖2可知，棕色素提取率隨提取溫度的升高先升高后下降。30～40℃之間提取率上升趨勢較為平緩，40～50℃時提取率上升明顯，這是因為溫度升高有利于色素的溶出。但50～60℃時提取率變化趨緩，超過60℃時，棕色素的提取率隨提取溫度的升高而下降，這可能是因為溫度過高導致部分溶劑揮發和部分色素分解。因此，可以初步確定60℃為提取溫度優化實驗的中心值。

圖1 液料比對棕色素提取率的影響Fig.1 Effects of liquid-solid ratio on extraction yield of brown pigments

圖2 提取溫度對棕色素提取率的影響Fig.2 Effects of extraction temperature on extraction yield of brown pigments

2.1.3 提取時間

如圖3所示，在35 min的浸提時間以內，棕色素提取率隨提取時間的延長而明顯增加，這是因為，浸提時間的延長，超聲波破壞山核桃外果皮中細胞壁的可能性越大，溶出的色素量越多。隨著浸提液中棕色素達到一定濃度后，再延長提取時間，棕色素的溶出量不會大幅增加，同時卻使能耗增加。因此，選擇35 min為優化工藝中提取時間的中心值。

2.2 響應面法優化提取工藝

2.2.1 試驗設計及結果

響應面試驗設計結果見表2，用Design Ex?pert軟件對試驗進行回歸擬合分析，得到棕色素提取率與各因素變量的二次方程模型：

用軟件對模型進行方差分析，結果如表3所示。一次項液料比、一次項提取溫度、一次項提取時間對棕色素提取率的影響顯著；液料比與提取溫度的交互項、二次項液料比、二次項提取溫度和二次項提取時間對棕色素提取率的影響顯著，表明該方程并非簡單的線性關系，方程二次項對響應值影響也很大，部分交互影響顯著，這與模型分析的結果是相吻合的。

圖3 提取時間對棕色素提取率的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction yield of brown pigments

表2 響應面試驗設計與結果Tab.2 Experiment design and results of response surface methodology

表3 回歸模型方差分析Tab.3 Analysis of variances for the created regression model

模型相關系數的平方即R2＝0.966 6，經擬合檢驗P＜0.01差異極顯著，說明該方程能夠正確反映棕色素提取率與液料比、提取時間和提取溫度之間的關系。失擬檢驗P=0.332 6＞0.05，說明本試驗無其他因素的顯著影響。響應值的變異系數CV為0.90%，較低，說明試驗操作可信。

2.2.2 響應面分析

由F值檢驗得到的因子貢獻率為：X2＞X3＞X1。結合回歸方程做響應面圖，就可以很直觀看出優化區域及各因素對提取率的顯著程度。結果如圖4所示。提取溫度對棕色素提取率的影響最為顯著，隨其數值的增加或減少，響應值變化較大，表現為曲面較陡；液料比對棕色素提取率的影響較小，隨其數值的增加或減少，響應值變化較小，表現為曲面比較平滑。故各因素對提取率的影響順序：提取溫度＞提取時間＞液料比。

圖4 各因素交互作用對棕色素提取率影響的響應面圖Fig.4 Response surface plots of the pairwise interactive effects on brown pigment yield

2.3 最佳工藝條件的驗證

軟件分析預測棕色素的最大提取率為4.4%。與之對應的工藝條件為：提取時間39.33 min，液料比16.19 mL·g-1，提取溫度62.69℃。為檢驗響應面法優化核桃殼棕色素提取工藝的可靠性，采用優化后提取工藝條件進行驗證試驗，參考實際操作，將優化后工藝參數調整為提取時間40 min，液料比16 mL·g-1，提取溫度63℃。在此條件下，進行3組重復試驗，棕色素的平均提取率為4.2%，與預測的理論值相接近，驗證了該模型的有效性。

3 結束語

在單因素試驗設計的基礎上，對核桃殼棕色素的提取條件進行了3因素3水平的響應面法設計，從而建立了響應值和各個因素之間的數學模型，該模型回歸極顯著，對試驗擬合較好，有一定的應用價值。依據此數學模型并經優化驗證得到的最佳工藝參數為：液料比16 mL·g-1，提取時間40 min，提取溫度63℃。在上述最佳提取條件下，山核桃殼棕色素的提取率為4.2%。

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