丁香酚與硫氫化鈉促進番茄幼苗側根生長

徐慶宣，陳 健，黃曉芳，陳 浩，葉 敏，石志琦

(1.云南農業大學植物保護學院，云南 昆明 650000;2.江蘇省農業科學院食品質量安全與檢測研究所，江蘇 南京 210014)

側根是植物根系的重要組成部分，對養分吸收、錨定植株以及植株抗病方面起關鍵作用。側根的生長發育是遺傳因子和外部生物及非生物因素共同刺激作用的結果。許多外界環境因素如光照、溫度、二氧化碳、水分、營養元素、外源植物激素等都可影響到側根的生長［1-3］。丁香酚(Eugenol，4-烯丙基-2-甲氧基苯酚)是植物丁香揮發油的主要成分，具有抗氧化、殺菌消炎、解熱、麻醉、防腐、驅蚊等效果。陳浩等研究發現丁香酚對西葫蘆病毒病具有較好的防治效果，可以有效緩解染病植株葉片皺縮、矮化等癥狀［4］;蘇杭等研究結果表明丁香酚通過誘導煙草植株系統獲得抗性抗煙草花葉病毒病，并可以提高煙草植株葉綠素含量，說明丁香酚可通過調控植株生長抵抗病原菌侵染［5-7］。對于植物提取物促進側根發生活性已有報道［8］，進一步研究丁香酚促進植物側根的發育機理將有助于明確丁香酚對植物生長的調節作用。

硫化氫(H2S)是繼一氧化氮(NO)和一氧化碳(CO)之后發現的植物體內第三種氣體信號分子。最近的研究結果表明，H2S參與調控植物多種生理過程，如氣孔運動、不定根發育、增強光合作用、緩解干旱、滲透和金屬離子等多種非生物脅迫造成的傷害，且 Ca2+可作為 H2S下游信號發揮作用［9-12］。丁香酚是否并怎樣通過H2S調控植物側根發育值得深入研究。

本試驗以番茄為供試植株，研究丁香酚和H2S供體NaHS對番茄幼苗側根發生的影響，以及H2S清除劑對丁香酚和NaHS調控側根發生過程的影響。同時，根據根尖細胞內Ca2+的響應情況，研究丁香酚調控側根生長可能的信號響應途徑。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

番茄品種蘇紅2003，購于江蘇省農業科學研究院種子店;H2S供體硫氫化鈉 (NaHS)、H2S清除劑亞牛磺酸 (Hypotaurine，HT)均購自 Sigma公司;Ca2+熒光染料Flour-3 AM購于海門碧云天生物科技有限公司;其他試劑均為國產分析純。智能光照培養箱由寧波江南儀器廠生產。

1.2 試驗方法

1.2.1 植物培養 選取飽滿的番茄種子經5.0%次氯酸鈉(NaClO)消毒15 min后，用蒸餾水沖洗3～4次，于25℃黑暗中催芽，待根長為2～3 cm時挑選生長一致的番茄幼苗轉移培養槽光照培養箱中培養。光周期為14 h，溫度為25℃，每隔24 h更換1次Hoagland營養液。Hoagland營養液配方為NH4H2PO428.700 μmol/L，Ca(NO)2164.100 μmol/L，KNO3151.650 μmol/L，MgSO460.190 μmol/L，H3BO30.710 μmol/L，CuSO40.020 μmol/L，FeSO4·7H2O 1.330 μmol/L，MnSO4·H2O 0.604 μmol/L，MoO30.004 μmol/L，ZnSO40.055 μmol/L，各種鹽類單獨配置1000倍貯備液，用時稀釋，最后pH值調整到5.5。

1.2.2 番茄側根數目的統計 挑選根長一致且尚未長出側根的番茄幼苗轉移到Hoagland營養液中。(1)首先設定處理液濃度:丁香酚［0 μmol/L(對照)、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、30 μmol/L、35 μmol/L、60 μmol/L、120 μmol/L］，NaHS ［0 μmol/L(對照)、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L］，統計番茄幼苗側根數;(2)根據上述試驗結果，選取促進番茄側根生長效果最好的處理液(丁香酚和NaHS)分別處理番茄幼苗，每隔24 h統計番茄幼苗側根數;(3)根據上述試驗結果，選取促進番茄側根生長效果最好的處理液(丁香酚和NaHS)分別添加H2S清除劑200 μmol/L HT后處理番茄幼苗，統計番茄幼苗側根數。以上每個處理各30株苗，并設有3個重復，結果用Excel軟件進行統計分析。

1.2.3 Ca2+熒光檢測 將番茄根部切下，迅速吸干表面水分，然后浸入Flou-3 AM探針液內，避光放置30 min后，用蒸餾水沖洗根部，吸干表面水分，在熒光電子顯微鏡下觀察拍照。

2 結果

2.1 丁香酚和硫氫化鈉(NaHS)對番茄側根生長的影響

將番茄幼苗轉移到不同濃度的丁香酚和NaHS處理液中，培育5 d后，發現丁香酚和NaHS促進番茄側根生長呈現明顯的濃度效應。隨著丁香酚濃度的升高，番茄幼苗側根數目呈先增加后減少趨勢。當丁香酚濃度為5～35 μmol/L時，番茄幼苗平均側根數目顯著高于對照(P＜0.05);其中30 μmol/L丁香酚處理下的番茄幼苗平均側根數目最多，比對照高出60%左右。隨著丁香酚濃度的繼續升高(60 μmol/L和120 μmol/L)，番茄幼苗平均側根數目與對照間差異不顯著。NaHS作為H2S供體，可以給植株提供外源H2S。隨著NaHS濃度的升高，番茄幼苗側根數目呈先增加后減少趨勢。當NaHS濃度為10～40 μmol/L時，番茄幼苗平均側根數目顯著高于對照(P＜0.05);其中15 μmol/L NaHS處理下的番茄幼苗平均側根數目最多，為對照的2倍。隨著NaHS濃度的繼續升高(80 μmol/L)，番茄幼苗平均側根數目與對照間差異不顯著(圖1)。

選取30 μmol/L丁香酚和 15 μmol/L NaHS 分別處理番茄幼苗，每隔24 h統計其側根數目。結果(圖2)發現30 μmol/L丁香酚處理的番茄幼苗平均側根數目隨著處理時間延長而增加，且不同處理時間下番茄幼苗平均側根數目均顯著高于對照(P＜0.05)。表明，丁香酚對番茄側根發生的影響有明顯的濃度和時間效應。同樣，15 μmol/L NaHS處理下番茄幼苗平均側根數目隨著處理時間延長而增加，且不同處理時間下番茄幼苗平均側根數目均顯著高于對照(P＜0.05)。

圖1 不同濃度丁香酚和硫氫化鈉處理對番茄幼苗側根生長的影響Fig.1 The effects of different concentrations of eugenol and NaHS on the growth of tomato lateral root

圖2 30 μmol/L丁香酚和15 μmol/L NaHS處理對番茄幼苗側根生長的時間效應Fig.2 The time-dependent effect of 30 μmol/L eugenol and 15 μmol/L NaHS on the growth of tomato lateral root

2.2 H2S清除劑亞牛磺酸(HT)對丁香酚和硫氫化鈉調控番茄幼苗側根生長的影響

為了進一步研究丁香酚與H2S信號的關系在促進番茄幼苗側根生長過程中的作用，我們檢測了H2S清除劑HT對丁香酚和NaHS促進番茄幼苗側根生長的影響。結果表明，30 μmol/L丁香酚和15 μmol/LNaHS處理下番茄幼苗側根數目均顯著高于對照、30 μmol/L 丁 香 酚 +200 μmol/L HT、15 μmol/LNaHS+200 μmol/L和 200 μmol/L HT 處理(P＜0.05)。這說明H2S清除劑HT能夠減弱丁香酚和NaHS促進番茄幼苗側根生長的效應，表明H2S可能作為下游信號介導了丁香酚對側根生長的促進效應 (圖3)。

圖3 H2S清除劑亞牛磺酸(HT)對丁香酚和NaHS促進側根生長的影響Fig.3 The effect of H2S scavenger HT on eugenol-and NaHS-promoted growth of tomato lateral root

2.3 丁香酚和硫氫化鈉(NaHS)處理對番茄幼苗根內源Ca2+的影響

Ca2+原位熒光檢測結果顯示，番茄側根從側根原基發生到側根形成過程中都有Ca2+積累(圖4)，說明Ca2+對于番茄幼苗側根的發生必不可少。進一步的研究結果(圖5)顯示，丁香酚 (30 μmol/L)和NaHS(15 μmol/L)處理均能促進番茄根內Ca2+積累，而加入H2S清除劑HT后，顯著抑制了丁香酚促進Ca2+積累的效應。這說明，在丁香酚促進側根發育的過程中，Ca2+可能作為H2S的下游信號發揮作用。

圖4 番茄側根發育過程中內源Ca2+積累的熒光染色顯示Fig.4 Fluorescent staining of endogenous Ca2+during the development of tomato lateral root

3 討論

圖5 不同處理下番茄根細胞內Ca2+積累的熒光染色顯示Fig.5 Fluorescent staining of Ca2+in tomato root with different treatments

近年來，植物生根劑作為農藥中的一大重要類群，已廣泛應用于農、林、園藝等生產中，發揮了重要的作用。植物是天然化合物的寶庫，因此，從植物中尋找促生根活性物質，對開發新型高效、安全、與環境友好的生根劑具有重要意義［13］。了解天然化合物調控植株根發生機理，對開發和應用植物源生根劑有很好的指導意義。而目前，丁香酚研究主要集中于抗病性研究，關于其促側根活性，國內外尚未見報道。

本研究結果顯示30 μmol/L丁香酚處理的番茄幼苗平均側根數高出對照60%，具有很好的促側根活性。后續試驗發現丁香酚促側根活性可以被H2S清除劑HT抑制，由此推測丁香酚調控番茄側根發生與H2S信號相關。Lin等研究結果表明，H2S供體NaHS可以誘導黃瓜幼苗不定根的產生［14］;Zhang等發現H2S可以促進切根甘薯、旱柳和大豆幼苗不定根的發生［15］，由此可以看出，H2S信號響應在植物側根發育過程中普遍存在，而且可以通過NaHS添加外源H2S信號調控植株的側根發育活性;而低濃度的NaHS可以促進番茄側根的發生，因此，可以初步確定丁香酚通過H2S信號途徑調控番茄側根的生長。

Ca2+作為植物細胞內的第二信使，參與眾多生理過程。細胞質中Ca2+濃度的變化是行使其信使功能的基礎。有文獻報道Ca2+對擬南芥、水稻、萵苣幼苗有促進側根形成的作用，通過NaHS預處理煙草、蠶豆細胞可以致使細胞內Ca2+濃度大幅度上升，發揮生理調控作用［16-19］。本研究結果也顯示番茄側根發生過程與細胞內Ca2+濃度密切相關，而丁香酚和NaHS都可以通過顯著提高根尖細胞內Ca2+水平促進側根發生，并且這種作用可以被H2S清除劑HT抑制。由此我們可以推斷丁香酚作用番茄幼苗根細胞，介導了根細胞內H2S信號途徑，從而導致細胞外Ca2+內流或胞內Ca2+庫中Ca2+的釋放，使胞內Ca2+水平升高，Ca2+進一步激活下游信號，誘導了側根發生。

本研究初步闡明了丁香酚促進側根發生的部分機理，同時也為H2S參與植物側根發育提供了新的理論證據，但關于丁香酚如何調控H2S信號以及H2S與Ca2+信號的互作還有待進一步研究。

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