柳樹液泡膜ATP酶B亞基基因克隆及在鹽脅迫下的表達分析

李 敏，張 健，馮立國，李玉娟，馮新民，王 瑩，李婷琳

(江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇 如皋 226541;2.揚州大學(xué)園藝與植物保護學(xué)院，江蘇 揚州 225009)

植物液泡膜H+-ATPase的結(jié)構(gòu)是V型的，在逆 境應(yīng)答中的功能早已被關(guān)注，其分子質(zhì)量為400000～650000，由7～10個亞基組成，分為親水的V1亞基組和疏水的 V0亞基組［1］。V1由 A、B、C、D、E、F、G和H亞基組成，主要是催化ATP水解;而V0由a、c、c'、c″、d 和 e 亞基組成，主要是跨內(nèi)膜形成質(zhì)子通道［2］。多數(shù)研究表明，鹽或干旱脅迫能誘導(dǎo)C3、C4植物的V型H+-ATP酶的含量、活性和結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，尤其以兼性C3/CAM植物冰葉日中花(Mesembry-anthemum crystallinum)最為典型，在NaCl脅迫時，該植物的液泡膜H+-ATPase活性增加了7倍多［3］，說明V型H+-ATP酶是植物對逆境應(yīng)答的敏感位點。

柳樹(Salix viminalis L.)為楊柳科柳屬落葉喬木或灌木，生長速度快，是優(yōu)良的園林綠化樹種［4-5］。近年來，江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所開展了耐鹽柳樹的選育工作，并選育出了一系列耐/敏鹽柳樹無性系。與普通柳樹相比，耐鹽柳樹具有較強的耐鹽堿性，能在含鹽量4.0‰左右、pH值10.4的土壤中正常生長，是中國極具潛力的沿海灘涂造林樹種［6］，這些耐鹽柳樹資源為開展柳樹耐鹽機理研究提供了極好的試材。目前，有關(guān)柳樹泡膜ATP酶B亞基基因(VHA-B)的克隆及鹽脅迫表達方面的研究較少，本試驗擬以課題組選育出的耐鹽柳樹L0911無性系為試材，通過克隆獲得VHA-B基因，并分析其在鹽脅迫下的表達情況，為進一步開展植物抗逆性基因工程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

試材為江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所選育出的耐鹽柳樹L0911無性系，該品系是2009年5月在江蘇如東東凌沿海墾區(qū)種植的竹柳林下發(fā)現(xiàn)的幼苗，喬木，速生，新枝紅褐色，老枝灰紫色，觀賞性強。2009年秋天開始對L0911進行微體快繁，2011年對幾種柳樹進行水培鹽試驗，發(fā)現(xiàn)低濃度鹽對L0911莖高和根長的生長有一定促進作用，0.5%以上鹽濃度才在一定程度上抑制其生長，其耐鹽性明顯高于普通柳樹［7］。2010～2012年分別在大豐、啟東、海門、如皋等地種植，經(jīng)過近3年的試驗觀察，L0911表現(xiàn)出適應(yīng)性強、耐鹽堿性能好、觀賞性強、速生性明顯等優(yōu)勢。

L0911無性系采用0.5×Hoagland營養(yǎng)液水培，選擇生長健壯的幼苗(水插30 d，苗高12 cm，葉片數(shù)10張左右)用200 mmol/L NaCl溶液分別處理0 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h，取新鮮嫩葉片。另外將L0911幼苗分別用 0 mmol/L、100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L NaCl溶液處理48 h，取新鮮嫩葉片，用液氮速凍，并保存于-70℃冰箱待用。

1.2 試驗試劑

引物的合成、Taq DNA聚合酶、dNTP(10 mmol/L)、DNA marker和 PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(SK1141)、質(zhì)粒提取試劑盒(SK1191 UNIQ-10)、熒光定量PCR用試劑盒(SK8661)、常規(guī)化學(xué)試劑等均購自上海生工生物工程有限公司。pMD18-T載體購自大連寶生物(TaKaRa)。

1.3 RNA提取和總cDNA的合成

采用Trizol試劑(Invitrogen公司產(chǎn)品)，并參照試劑說明手冊提取總 RNA。總 cDNA的合成用AMV逆轉(zhuǎn)錄酶(BBI公司產(chǎn)品)并按照反轉(zhuǎn)試劑盒說明書進行。

1.4 柳樹L0911的VHA-B基因的克隆

以毛果楊(Populus trichocarpa)VHA-B設(shè)計了引物VHA-B F1:5'-CTCGCTGTGTACCAGAGCCAG-3';VHA-B R1:5'-TCAACTTCTTATAGCTCATAGA-3'。以L0911葉片總cDNA為模板，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖電泳后，切膠回收，并進行 T/A克隆(pMD18-T)。陽性克隆送上海生工生物工程有限公司測序。所得克隆序列為2次獨立PCR和3個以上質(zhì)粒測序的結(jié)果。

1.5 氨基酸序列分析和系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

用BLAST程序軟件從GenBank中篩選15個來源于不同物種VHA-B基因編碼的氨基酸序列，分別是:楊樹(Populus trichocarpa，XP_002305533)、水稻(Oryza sativa ssp.japonica，Os01g0711000)、擬南芥(Arabidopsis thaliana，NP_974707)、冰葉日中 花(Mesembryanthemum crystallinum，CAD27443)、鹽爪爪(Kalidium foliatum，ABK91686)、苜蓿(Medicago truncatula，EF153483)、鹽穗木(Halostachys caspica，ABO45932)、堿蓬(Suaeda salsa，AAO73463)、小麥(Triticum aestivum，ABN54974)、玉米 (Zea mays，NM_001159193)、 煙 草 (Nicotiana tabacum，AAF26445)、傘藻屬蝶狀藻(Acetabularia acetabulum，BAA09099)、螞 蟻 (Harpegnathossaltator，EFN82772)、棉 鈴 蟲 (Helicoverpa armigera，ADK94761)、黑腹果蠅(Drosophila melanogaster，NP_476908)。利用 DNA MAN軟件將這些序列與L0911的VHA-B基因編碼的氨基酸序列進行比對和系統(tǒng)進化樹分析。

1.6 實時熒光定量PCR分析L0911 VHA-B基因鹽脅迫處理的響應(yīng)

根據(jù)測序結(jié)果，設(shè)計引物VHA-B F2(5'-TAGCTGCTCAAATATGTCGCC-3')和VHA-B R2(5'-GCCAAGTTTAGAAAGAGGGTCAC-3')，對 L0911 VHA-B基因鹽脅迫處理后的響應(yīng)進行分析。用ubiquitinlike(UBQ-L)為內(nèi)參基因［8］，引物為 UBQ-L-F(5'-TGAGGCTTAGGGGAGGAACT-3')和UBQ-L-R(5'-TGTAGTCGCGAGCTGTCTTG-3')。將上述鹽處理的柳樹L0911幼苗按1.3方法進行總RNA提取以及cDNA合成。按模式植物總RNA抽提純化試劑盒(SK8661)操作配制PCR體系，于ABI Stepone plus型熒光定量PCR儀中進行定量PCR檢測，3次重復(fù)，測定其 Ct值，用 F=2-△△Ct公式［9］計算出樣品間目的基因的表達量差異。

2 結(jié)果

2.1 柳L0911 VHA-B基因的克隆

用毛果楊(Populus trichocarpa)PtVHA-B基因設(shè)計的引物F1和R1能在柳L0911的cDNA模板中成功擴增(圖1)，且長度大小符合預(yù)期。進一步通過克隆測序后分析表明，L0911 VHA-B基因cDNA全長1566 bp，具有起始密碼子、完整的開放閱讀框(1467 bp)、終止密碼子、5'非編碼區(qū)(41 bp)和3'非編碼區(qū)(58 bp)，共編碼518個氨基酸。這與測序結(jié)果一致，表明已成功獲得該基因的全長cDNA序列。在GenBank通過NCBI同源性搜索，比對顯示該序列編碼的氨基酸序列與楊樹、水稻、小麥、擬南芥、煙草、冰葉日中花、堿蓬、鹽爪爪的相應(yīng)基因編碼氨基酸序列一致性達到95.88%，說明該基因?qū)儆赩HA-B家庭成員。

圖1 引物VHA-B F1/R1擴增的PCR產(chǎn)物Fig.1 Agarose gel electrophoretic analysis of PCR product of VHA-B using VHA-B F1/R1

2.2 蛋白質(zhì)序列系統(tǒng)進化分析

耐鹽柳樹L0911 VHA-B基因編碼蛋白質(zhì)長度為487個氨基酸，分子量為54040，等位點是4.61。采用DNA MAN軟件對L0911 VHA-B基因進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果見圖2，可以看出，本研究獲得的柳樹L0911的VHA-B基因與楊樹位于相同分支，相似性最高，達到97%，與擬南芥、冰葉日中花、苜蓿、鹽爪爪、鹽穗木、堿蓬、小麥、玉米、煙草相似性也較高，達到90%以上，與傘藻屬蝶狀藻相似性達到80%以上，與螞蟻、棉鈴蟲、黑腹果蠅相似性達到75%以上。圖中顯示了高等植物、低等植物和昆蟲各聚為一類，說明液泡膜VHA-B基因進化與生物學(xué)進化一致。從圖中不同種類氨基酸序列分析，VHA-B亞基的保守性較高，并且在長期的進化過程中，VHA-B亞基逐步適應(yīng)環(huán)境演變。

2.3 鹽脅迫下L0911 VHA-B基因的表達分析

2.3.1 不同濃度NaCl溶液相同時間脅迫下的表達特性 柳L0911幼苗經(jīng)不同濃度的NaCl溶液脅迫處理48 h，提取葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行熒光定量PCR，并進行溶解曲線分析，所得溶解曲線呈現(xiàn)單峰可進行數(shù)據(jù)分析。

以未進行NaCl脅迫處理48 h的葉片中BADH基因的表達量為對照，將實時熒光定量中得到的目的基因L0911 VHA-B和內(nèi)參基因UBQ-L的平均Ct值，代入 F=2-△△Ct公式進行計算并作圖，得到圖3。從圖3可以看出L0911葉片中VHA-B基因的表達量隨著鹽濃度的升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在200 mmol/L NaCl脅迫下表達量最高，為對照的2.64倍。說明一定濃度的 NaCl脅迫可以誘導(dǎo)L0911的VHA-B基因表達量的增加，但鹽濃度達到300 mmol/L，脅迫48 h時VHA-B基因表達量下降。

2.3.2 相同濃度NaCl溶液不同時間脅迫下的表達特性 用200 mmol/L NaCl溶液處理L0911幼苗，分別在 0 h、12 h、24 h、48 h、72 h、96 h 提取葉片的總RNA，反轉(zhuǎn)錄后進行熒光定量PCR分析。以未經(jīng)NaCl脅迫處理的葉片中VHA-B基因的表達量為對照，將目的基因VHA-B和內(nèi)參基因UBQ-L的平均Ct值代入公式F=2-△△Ct進行計算并作圖，得到圖4。從圖4可以看出，隨著鹽脅迫時間的延長，葉片中VHA-B基因表達量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在鹽脅迫72 h時達到峰值，為對照的3.46倍，說明鹽脅迫能誘導(dǎo)該基因表達量的增加。隨著時間進一步延長，在96 h時葉片中該基因的表達量開始下降，為對照組的2.02倍。

圖2 基于VHA-B蛋白不同物種的進化樹Fig.2 Phylogenetic analysis based on VHA-B proteins

圖3 不同NaCl濃度處理后48 h L0911葉片中VHA-B基因表達Fig.3 Expression of VHA-B gene in the leaves of L0911 under different concentrations of NaCl stress for 48 h

圖4 200 mmol/L NaCl處理不同時間L0911葉片中VHA-B基因的表達Fig.4 Expression of VHA-B gene in the leaves of L0911 under 200 mmol/L NaCl stress for different periods of time

3 討論

液泡膜ATPase B亞基屬于真核生物ATPase家族，是一個重要的不具備催化活性的調(diào)節(jié)亞基，定位在V1結(jié)構(gòu)域［10］。本研究克隆了柳樹 L0911的VHA-B基因，測序結(jié)果表明，L0911的VHA-B含有1個完整的開放閱讀框架，核苷酸序列長為1566 bp，推測的氨基酸序列全長為518個氨基酸殘基。氨基酸序列與楊樹、水稻、擬南芥、冰葉日中花、堿蓬、鹽爪爪等高等植物的相應(yīng)氨基酸序列一致性達到95%。堿蓬和冰葉日中花的VHA-B蛋白功能已有報道［11-12］，推測L0911的VHA-B蛋白也具有該生物學(xué)功能。

當植物處于逆境條件下，液泡膜上的ATPase可以改變結(jié)構(gòu)以適應(yīng)環(huán)境的變化，從而得以存活。本試驗用熒光定量的方法檢測L0911在鹽脅迫下，VHA-B基因mRNA的表達情況，結(jié)果表明，VHA-B基因是受鹽誘導(dǎo)的，隨著鹽濃度的升高表達量增大，至鹽濃度200 mmol/L時表達量最大，為對照的2.64倍;在同一鹽濃度下，隨著鹽脅迫時間的延長，其表達量也增大，72 h時表達量是對照的3.46倍。Li等［11］的研究表明堿蓬(Suaeda salsa)從Northern及Western印跡上顯示液泡膜H+-ATPase B亞基表達明顯受NaCl脅迫誘導(dǎo)。曾幼玲［13］的研究表明鹽爪爪(Kalidium foliatum)的VHA-B基因隨著NaCl脅迫濃度的增加表達持續(xù)增強，與本研究結(jié)果相似，說明L0911的VHA-B基因在一定時間內(nèi)是受鹽誘導(dǎo)的。

［1］羅以篩.鹽脅迫下植物質(zhì)膜和液泡膜H+-ATPase活性的研究進展［J］. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(3):1263-1265.

［2］朱家紅，張全琪，蔡元保，等.巴西橡膠樹液泡ATP酶F亞基基因克隆及表達［J］.西北植物學(xué)報，2009，29(6):1079-1083.

［3］張?zhí)煊睿帑惼迹?陽，等.柳樹愈傷組織的誘導(dǎo)研究［J］.山東林業(yè)科技，2007(2):17-19.

［4］BINZEL M L，HESS F D，RAY A B，et al.Intracellular compartmentation of ions in salt adapted tobacco cells［J］.Plant Physiol，1988，86:607-614.

［5］張 健，李 敏，李玉娟，等.鹽脅迫下3個柳樹新品系生理指標的變化［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(8):197-199.

［6］解孝滿，李景濤，劉建軍，等.柳樹無性系苗期試驗分析［J］.山東林業(yè)科技，2008(3):44-45.

［7］李 敏，張 健，李玉娟，等.鹽脅迫對不同柳樹種質(zhì)幼苗生長的影響［C］//中國林學(xué)會，南京林業(yè)大學(xué).第十屆中國林業(yè)青年學(xué)術(shù)年會論文集.南京:南京林業(yè)大學(xué)，2012:37-43.

［8］關(guān)亞麗.柳樹AP3同源基因的克隆與表達分析［D］.南京:南京林業(yè)大學(xué)，2006.

［9］KENNETH J，LIVAK，THOMAS D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-△△Ct method［J］.Method，2001，25:402-408.

［10］XIA M，WANG X B，LI H B，et al.Identification of the rice vacuolar ATPase B subunit gene and its expression pattern analysis under phosphorus deficiency［J］.Acta Botanica Sinica，2002，44(5):573-578.

［11］LI P H，WANG Z L，ZHANG H，et al.Cloning and expression analysis of the B subunit of V-H+-ATPase in leaves of halophyte Suaeda salsa under salt stress［J］.Acta Botanica Sinica，2004，46(1):93-99.

［12］TSIANTIS M S，BARTHOLOMEW D M，SMITH J A C.Salt regulation of transcript levels for the c subunit of a leaf vacuolar H+ATPase in the halophyte Mesembryanthemum ctystallinum［J］.Plant J，1996，9(5):729-736.

［13］曾幼玲.鹽爪爪和鹽穗木的耐鹽生理生化及耐鹽相關(guān)基因的克隆與表達研究［D］.烏魯木齊:新疆大學(xué)，2007.