白腐菌對水葫蘆木質纖維素的降解及對厭氧發酵的影響

范曉娟， 朱紅梅， 韓士群， 周 慶， 楊天元， 王世梅

(1.南京農業大學資源與環境科學學院，江蘇 南京 210095;2.蘇州市吳江區松陵鎮農業服務中心，江蘇 蘇州 215200;3.江蘇省農業科學院農業資源與環境研究所，江蘇 南京 210014)

隨著水體富營養化問題越來越嚴重，采用水葫蘆等水生植物消減水體氮、磷等富營養化物質成為改善水質的重要措施，但大量水葫蘆若堆積又會產生二次污染，亟需進行資源化利用。現有水葫蘆資源化利用方式中，較為普遍的是將其與其他物料如污水塘底泥、動物糞便等混合進行好氧或厭氧堆制，產生沼氣及制得有機肥［1-5］或制成動物飼料［6-7］。近年來，由于能源危機日益加劇，水葫蘆等水生植物作為生物質能利用的研究逐漸引起科技工作者們的興趣。

水葫蘆有較高的可發酵物質，具有較強的產沼氣潛力［8-9］，但其木質纖維素的結構和含量是生產沼氣的瓶頸［9-10］。木質纖維素主要由纖維素、半纖維素和木質素組成，而降解木質纖維素的關鍵是去除木質素［11-12］。為了提高沼氣產率，需要對水葫蘆進行一定的預處理。目前國內外學者也已對水葫蘆發酵的預處理做了大量研究，如Moorhead等［8］認為適當的水葫蘆粒徑可以提高沼氣總產量以及甲烷產量;Patel等［13］發現利用熱化學方法將水葫蘆預處理后厭氧發酵可以提高沼氣產量;陳曉曄等［14］的研究表明一定濃度的硫酸預處理可以提高水葫蘆的甲烷產量且縮短系統啟動期。上述預處理大多采用物理、化學方法，而關于微生物預處理水葫蘆的研究不多。

白腐真菌是對木質素具有最強降解能力的一類真菌，經其轉化后的稻草基質用于沼氣生產時，其纖維素酶的釋放能力比原稻草要高4.3倍［15］。從理論上講，利用白腐菌生物預先降解木質纖維素含量較高的秸稈，以提高隨后的厭氧消化產氣率是可行的。Ghost［16］等研究發現白腐菌黃孢原毛平革菌菌絲體4 d后表現出巨大的木質素降解能力，3周后其菌絲體對秸稈木質素的降解率為47.51%，稻秸的生物氣和甲烷產量分別提高了34.73%和46.19%。本研究將采用白腐真菌的黃孢原毛平革菌和糙皮側耳，分別對水葫蘆木質纖維素進行降解預處理，并研究其對厭氧發酵產沼氣的影響，探求水葫蘆高效產沼氣的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

水葫蘆:江蘇省農業科學院2號塘，洗凈，風干，總固體含量(TS)為91.45%。

菌種:黃孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)，購于中國工業微生物菌種保藏中心;糙皮側耳(Pleurotus ostreatus)，由本實驗室留存。

基礎培養液:KH2PO40.20 g/L，MgSO4·7H2O 0.05 g/L，CaCl20.01 g/L和1 ml/L無機鹽溶液，維生素B1100 mg/L，吐溫-80 0.05%［17］。無機鹽溶液為0.50 g/L MnSO4·H2O，0.01 g/L AlK(SO4)2·12H2O，0.01 g/L H3BO3，0.01 g/L Na2MoO4· 2H2O，0.10 g/L FeSO4·7H2O，0.10g/L CoCl2· 6H2O，0.10 g/L ZnSO4·7H2O，0.01 g/L CuSO4· 5H2O，3.00 g/L MgSO4·7H2O［18］。

厭氧消化試驗所用沼液總固體(TS)含量為2.16%，揮發性固體(VS)為56.55%，pH為8.34。

1.2 方法

1.2.1 水葫蘆木質纖維素的降解試驗 將黃孢原毛平革菌和糙皮側耳分別在30℃和28℃溫度下活化，150 r/min轉速搖床培養7 d后，用滅菌濾紙過濾，滅菌水沖洗3次，至濾紙不再滴水。

稱取自然風干、粉碎過20目篩的水葫蘆40 g于1 000 ml錐形瓶中，按固液比1∶2加入基礎培養液，自然pH，加水調節含水率至75%，封口后于120℃下滅菌30 min。冷卻至室溫后以20%的接種量(以濕重計)接種上述過濾得到的菌體，接種后放入恒溫恒濕培養箱，調節濕度75%，分別在30℃和28 ℃溫度下培養，分別于5 d、10 d、15 d、20 d、25 d、30 d取樣，測定纖維素、半纖維素、木質素等指標。每個處理設3個重復。

1.2.2 降解產物的厭氧發酵試驗 試驗所用發酵裝置為自制簡易裝置，見圖1。發酵瓶為1 L的廣口瓶，瓶口改用膠塞，膠塞上有兩孔，插入玻璃管后用橡膠管連接，分別為取樣口和導氣口，發酵罐與集氣瓶之間的導氣管連接一個取氣裝置。氣體收集瓶為1 L，采用排水法收集氣體，通過測量排出水的體積獲得沼氣產量。

采用濕發酵方法:取TS為39.36 g預處理10 d、15 d、25 d后發酵原料(濕料)，加入接種沼液400 g(TS為2.16%)，加水將發酵物總質量調整至600 g，此時發酵罐里的TS負荷均為8%。密封后，于35±1℃下進行厭氧發酵。對照處理為不加菌體的原料，同時設置只添加厭氧消化沼液不添加發酵材料的沼液對照，以扣除接種沼液本身產氣量。每個處理做2個重復，具體試驗設計如表1。

圖1 厭氧發酵裝置結構示意圖Fig.1 Schematic map of anaerobic digestion equipment

表1 厭氧發酵試驗設計Table 1 Design of the anaerobic digestion experiment

1.2.3 測定項目及方法 采用范氏法(Van Soest)［19］測定纖維素、半纖維素和木質素;以排水集氣法收集氣體，每日測定產氣量;采用GC-9890A氣相色譜儀分析沼氣中甲烷含量(TCD檢測器);干物質的測定采用105℃烘24 h差重法;pH值采用雷磁pHS-2F型酸度計測定;揮發性脂肪酸(VFA)的測定采用比色法。

1.2.4 數據整理與統計 所有數據均扣除空白對照樣后進行后續處理與分析。數據均用Sigma-Plot10、SPSS13.0軟件進行處理和統計分析。

2 結果

2.1 降解過程中水葫蘆木質纖維素含量的變化

由圖2可見，黃孢原毛平革菌和糙皮側耳兩種白腐菌對木質素、纖維素、半纖維素均有不同程度的降解，對木質素的降解較為明顯，接種30 d后，木質素含量分別降到6.93%、8.36%，降解率分別為39.42%和26.92%。兩種白腐菌均在接種第10 d就對木質素有較強的降解效果。木質素、纖維素、半纖維素的降解率均隨處理時間延長而增加，30 d后兩菌對纖維素的降解率分別為15.39%、13.44%;對半纖維素的降解率分別為16.77%、14.42%。

2.2 水葫蘆厭氧發酵的產酸特征

各處理在反應過程中pH值和揮發性脂肪酸的濃度有著相反的變化趨勢(圖3)，揮發性脂肪酸濃度升高時pH值下降。水葫蘆厭氧發酵酸化速度很快，各處理的pH值均在第2 d就達到最低值，黃孢原毛平革菌預處理10 d、15 d、25 d各組的最低值分別為7.40、7.56、7.31，糙皮側耳預處理10 d、15 d、25 d 各組的最低值分別為 7.14、7.15、7.39，對照組的最低值為7.22。各處理組的pH在達到最低值后隨即開始回升，第5 d至第30 d穩定在一定范圍內，隨后顯著下降。相應的，各處理的揮發性脂肪酸濃度在發酵第2 d達到最高，其中黃孢原毛平革菌預處理10 d、15 d、25 d各組的揮發性脂肪酸最高濃度分別為1 010.15 mg/L、1 446.70 mg/L、936.55 mg/L，由糙皮側耳預處理10 d、15 d、25 d的揮發性脂肪酸最高濃度分別為1 524.11 mg/L、1 366.75 mg/L、1 120.56 mg/L，對照組的揮發性脂肪酸最高濃度為2 395.94 mg/L。各處理組的揮發性脂肪酸濃度達到最高值后開始下降，在第7 d達到一個較低的穩定值，而對照組在第11d才達到較低穩定值，并持續到發酵結束。以對照為例，統計分析得，揮發性脂肪酸濃度與pH值呈極顯著負相關(r=－0.840＊＊，P＜0.01)，表明水葫蘆水解產生的有機酸是造成發酵液中pH值下降的最重要原因。

圖2 降解過程中木質纖維素含量的變化Fig.2 The variation of lignocellulose content in the process of degradation

圖3 厭氧發酵中發酵液pH值和揮發性脂肪酸濃度的變化Fig.3 Changes of pH values and valotile fatty acid contents during anaerobic digestion of water hyacinth

2.3 水葫蘆厭氧發酵的產氣特征

2.3.1 日產氣量 從圖4a、4b可見，各處理厭氧反應期間的日產氣量變化趨勢大致相同，均在3～5 d達到第1個產氣最高峰，然后下降并且持續一段時間后在25～27 d達到第2個產氣高峰，此后一直維持在一個較低的產氣量水平，直至發酵結束;水葫蘆發酵的啟動時間較快，發酵第1 d就達到一個較高的產氣量。由糙皮側耳處理了10 d、15 d的兩組和對照組在發酵第2 d日產氣量驟降，1～2 d后就迅速回升，達到一個產氣高峰(圖4b)，而由黃孢原毛平革菌處理的各組日產氣量在第2 d并沒有出現下降現象而是持續增加至第1個產氣高峰(圖4a)。

圖4 水葫蘆厭氧發酵過程中日產氣量的變化Fig.4 Daily biogas production during anaerobic digestion of water hyacinth

2.3.2 累積產氣量 對各處理在厭氧反應期間的產氣進行累積計算，結果見圖5。圖5顯示，對照組在28 d就停止了產氣，而兩菌10 d和15 d的處理組則繼續產氣直至發酵結束。由黃孢原毛平革菌預處理10 d、15 d，累積產氣量分別較對照提高了48.72%、59.11%(圖5a);經糙皮側耳處理10 d、15 d的累積產氣量分別較對照提高了70.96%、75.05%(圖5b)。而由黃孢原毛平革菌預處理25 d和由糙皮側耳預處理25 d的兩組累積產氣量分別下降了13.31%和76.54%。

圖5 水葫蘆厭氧發酵中累積產氣量的變化Fig.5 Accumulative biogas production during anaerobic digestion of water hyacinth

2.3.3 甲烷含量 從圖6可見，各處理甲烷含量的變化趨勢大體一致:在發酵前4 d，甲烷含量呈直線趨勢迅速上升，第5 d、第6 d繼續緩慢上升達到各自的一個較穩定的值，此后甲烷含量變化不大并維持較長一段時間，發酵進行到25 d后，各處理組及對照組的甲烷含量稍有下降。第6 d時，由黃孢原毛平革菌分別預處理10 d、15 d、25 d的3組甲烷含量分別為50.63%、55.16%、51.47%(圖6a);由糙皮側耳分別預處理10 d、15 d、25 d的3組甲烷含量分別為56.85%、55.47%、54.57%(圖6b)，而對照組的甲烷含量為59.87%。統計分析結果顯示，黃孢原毛平革菌各處理組和糙皮側耳多處理組的甲烷含量與對照組的甲烷含量無顯著性差異(P＞0.05)。

圖6 水葫蘆厭氧發酵所產沼氣中甲烷含量的變化Fig.6 Dynamics of methane content during anaerobic digestion of water hyacinth

2.3.4 單位TS產氣量和單位TS甲烷產量 從表2可見，由黃孢原毛平革菌預處理10 d、15 d，水葫蘆單位TS產氣量分別較對照提高48.73%、59.11%;由糙皮側耳處理10 d、15 d，水葫蘆單位TS產氣量分別較對照提高70.96%、75.05%。處理25 d時黃孢原毛平革菌和糙皮側耳兩組的單位TS產氣量反而分別下降了13.31%、76.55%。對于單位TS甲烷產量，由黃孢原毛平革菌預處理10 d、15 d，TS甲烷產量較對照分別提高了30.53%、35.44%;由糙皮側耳處理10 d、15 d，TS甲烷產量較對照分別提高了54.28%、55.81%。處理25 d時，黃孢原毛平革菌和糙皮側耳兩組單位TS甲烷產量分別下降了21.80%和77.33%(表2)。

表2 水葫蘆的產氣情況Table 2 Gas production during anaerobic digestion of water hyacinth

3 討論

3.1 白腐菌對木質纖維素的降解效果

由于纖維素易與半纖維素、木質素等難分解的物質相復合，利用纖維素之前，必須把它從木質素和半纖維素包裹中釋放出來，而半纖維素比木質素易降解，因此，纖維素的分解關鍵就在于木質素的降解［12］。杭怡瓊等［20］用稻草秸稈作基質接種不同白腐菌株，白腐菌對木質素的降解率平均可達37.76%。本試驗中，接種30 d，黃孢原毛平革菌和糙皮側耳對木質素的降解率分別為39.42%和26.92%，與稻草木質素降解效果相近。同時纖維素和半纖維素也有不同程度的降解，接種30 d，黃孢原毛平革菌對水葫蘆纖維素、半纖維素的降解率分別為15.39%、16.77%，糙皮側耳對其纖維素、半纖維素的降解率分別為13.44%，14.42%，而趙華等［21］用白腐菌在固態培養條件培養25 d后對稻草秸稈中纖維素、半纖維素的降解率分別為25.10%和29.80%，水葫蘆的纖維素、半纖維素降解率低于稻草。

3.2 水葫蘆厭氧發酵過程的產酸特性

揮發性脂肪酸是厭氧消化過程中極為重要的一個中間產物，也是最重要的產甲烷前體物質，在發酵過程中，對揮發性脂肪酸和pH值的監控對于系統的正常運行及較高的沼氣質量都是非常重要的。統計分析得，各處理組與對照組的揮發性脂肪酸含量無顯著性差異(F=0.549，P=0.769)。對揮發性脂肪酸含量與產氣量進一步分析，揮發性脂肪酸的高峰值出現在產氣量增加的前期，這是由于有機酸的大量積累造成pH值降低，從而影響了產甲烷菌的活性，但與此同時，揮發性脂肪酸的積累也為甲烷菌生長繁殖提供了大量的物質來源，隨著產甲烷菌活性逐步增加，有機酸底物隨后被甲烷菌充分利用后形成了產氣高峰［22］。統計分析可知，由糙皮側耳處理10 d、15 d的兩組揮發性脂肪酸含量與日產氣量均呈顯著正相關(r=0.703*，P＜0.05;r=0.679*，P＜0.05);其他處理的揮發性脂肪酸含量與日產氣量相關性不顯著(P＞0.05)。

3.3 白腐菌對水葫蘆的降解預處理對產氣特性的影響

經白腐菌處理10 d、15 d后，水葫蘆中難降解的木質素、纖維素等均有所降解，從而提高了發酵材料的利用率。采用相關分析，單位TS產氣量與木質素含量呈顯著負相關(r=－0.957*，P＜0.05)，與纖維素含量呈顯著負相關(r=－0.906*，P＜0.05)，與半纖維素含量相關性不顯著(r=－0.724，P＞0.05)。而經白腐菌預處理25 d，木質素、纖維素雖然進一步降解，但單位TS產氣量反而降低，可能是白腐菌預處理的時間過長，微生物本身生理活動消耗了一定的產沼氣底物。因此，生產上要控制合適的預處理時間。

對整個發酵過程中各處理組和對照組的甲烷含量做統計分析，由黃孢原毛平革菌和糙皮側耳預處理10 d、15 d、25 d的甲烷含量與對照組的甲烷含量無顯著性差異;將木質素、纖維素、半纖維素含量分別與平均甲烷含量做相關分析可知，平均甲烷含量與木質素、纖維素、半纖維素含量相關性均不顯著。推測，白腐菌的降解處理對甲烷含量沒有明顯的促進作用。

對于單位TS甲烷產量，兩菌分別處理10 d、15 d單位TS甲烷產量較對照組均有顯著提高，而處理25 d后，黃孢原毛平革菌和糙皮側耳兩組單位TS甲烷產量較對照顯著降低。說明用黃孢原毛平革菌或糙皮側耳對水葫蘆進行降解處理后，用于厭氧發酵產沼氣是可行的，但預處理時間不宜過長，生產上要控制合適的預處理時間。

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