脊髓Toll樣受體4在慢性瘙癢中的作用研究＊

孔 敏，周 芳，黨秀靜，武靜茹

（徐州醫學院／江蘇省麻醉學重點實驗室，江蘇 徐州 221002）

瘙癢是危害人類健康、影響人類生活質量最常見的臨床病癥之一。流行病學調查顯示，普通人群瘙癢的發病率為8%～12%［1］，臨床上瘙癢癥狀可見于許多疾病及一些藥物的不良反應［2－4］，其雖不致死卻給患者生存和生活帶來諸多不便［5］。最近研究發現，Toll樣受體（Toll－like receptor，TLR）家族參與瘙癢過程，比如TLR7介導了氯喹引起的急性瘙癢行為［6］，TLR2參與了溢脂性皮炎的發病過程［7］。TLR7與TLR家族中另一個成員TLR4在脊髓均有豐富的表達且分享諸多下游信號通路［8－9］，而后者在瘙癢過程中的作用，尤其是慢性瘙癢過程中的作用尚有待研究。因此，本研究擬探討脊髓TLR4在噁唑酮引起的慢性瘙癢中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇雄性昆明小鼠152只，體質量18～20g，由徐州醫學院實驗動物中心提供。于24℃下和晝夜交替的環境中飼養，自由攝食、飲水。所有動物適應環境7d后進行實驗。本研究獲得徐州醫學院動物實驗倫理委員會批準。

1.2 主要試劑 噁唑酮購自Sigma公司，用丙酮溶解至0.5%；表 沒 食 子 兒 茶 素 沒 食 子 酸 酯 （epigaloctechin－3－gallt，EGCG）購自上海源葉生物科技有限公司；TLR4和β－肌動蛋白（β－actin）一抗購自Abcom公司，對應二抗和Western blot顯色試劑盒購自碧云天生物科技有限公司。

1.3 模型制作 按照文獻［10］的方法，實驗前1d，瘙癢部位脫毛。在動物頸背部脫毛處一次性涂抹噁唑酮（10μL，0.5%，溶于丙酮），7d后（時間重新從零計數，因此，首次刺激當天記作－7d）開始激發，在第0、2、4、7、9、11天給予同等劑量噁唑酮進行激發，觀察行為學和分子生物學改變。

1.4 行為學觀察 所有實驗動物在激發前均放入15cm×15 cm×15cm的透明玻璃盒子中適應1h，涂抹溶媒或噁唑酮后重新放入盒子觀察其搔抓行為。動物從后爪抬起到接觸頸背部皮膚，不管其在瘙癢部位搔抓多長時間均記為一次完整的搔抓動作，最后以30min內完成的搔抓次數來衡量搔抓行為。

1.5 分組及處理 研究噁唑酮制慢性瘙癢模型，將小鼠隨機分為3組：對照組（C組）40只，只在頸背部脫毛，不做任何處理；丙酮溶媒組（A組）40只，頸背部脫毛處涂抹10μL丙酮；噁唑酮組（O組）40只，頸背部脫毛處涂抹10μL噁唑酮。每組再分為－7、0、4、9、11d5個亞組（n＝8），按模型制作方法涂抹相應試劑，并在觀察激發后30min內的行為學改變之后立即處死小鼠取脊髓頸膨大檢測TLR4。在確定噁唑酮致慢性瘙癢后9d小鼠脊髓TLR4表達水平接近高峰的基礎上，為研究腹腔注射EGCG的作用，將小鼠隨機分為丙酮溶媒組（A組）、丙酮溶媒＋EGCG組（A＋E組）、噁唑酮組（O組）和噁唑酮＋EGCG組（O＋E組），n＝8。各組在第9天激發后8h開始腹腔注射EGCG（40mg／kg）或生理鹽水，每8小時1次，直到第11天激發前，共計6次，最后一次給藥30min后激發，觀察激發后30min內的行為學改變，之后立即處死小鼠取脊髓頸膨大檢測TLR4。

1.6 Western blot檢測 －7d組在首次刺激后30min、其余各組在激發30min后隨機取6只小鼠，斷頭處死，快速取出脊髓組織，勻漿后，4℃下10 000×g離心30min，收集上清液，采用BCA（bicinchonininc acid）法測定蛋白濃度，蛋白樣品于－80℃保存。蛋白樣本按1∶4加入5×SDS－PAGE上樣緩沖液，95℃變性5min，每孔加樣30μg用10%SDS－PAGE電泳，轉至硝酸纖維素膜上。加入1∶500稀釋的抗TLR4或β－actin一抗4℃過夜，TBST緩沖液，10×（Tris Buffered Saline Tween－20，10×）洗膜后，加入1∶1 000稀釋的堿性磷酸酶標記的羊抗兔二抗（購自中國南京碧云天生物科技有限公司）室溫孵育1h，NBT／BCIP試劑盒（購自中國南京碧云天生物科技有限公司）顯色。掃描條帶，采用Adobe Photoshop軟件分析各組灰度值，并以激發前TLR4表達為整體進行標準化后反映TLR4的表達水平。

1.7 統計學處理 應用SPSS11.0軟件進行統計學數據分析，計量資料以表示，組間比較采用q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

與首次激發前相比，激發后各時間點小鼠的脊髓TLR4表達逐漸增加（圖1），且與搔抓行為呈正相關關系（r＝0.947）。3組小鼠在不同時間點30min內的搔抓次數見表1。

在EGCG腹腔注射實驗中（圖2～3），與噁唑酮組相比，O＋E組小鼠搔抓次數明顯減少（P＜0.05）、脊髓TLR4表達明顯降低（P＜0.05），但仍高于丙酮溶媒組和 A＋E組（P＜0.05）。丙酮溶媒組和A＋E組的搔抓次數及TLR4表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。

圖1 首次刺激及激發后各時間點脊髓TLR4表達

圖2 4組小鼠搔抓次數比較

圖3 4組小鼠脊髓頸膨大TLR4表達水平比較

表1 3組小鼠不同時間點30min內搔抓次數比較（，次）

表1 3組小鼠不同時間點30min內搔抓次數比較（，次）

＊：P＜0.05，與噁唑酮組比較。

組別 n －7d 0d 4d 9d 11d對照組 40 2.03±0.27 2.13±0.35＊ 2.00±0.93＊ 2.00±0.76＊ 2.38±0.74＊丙酮溶媒組 40 2.21±0.37 2.22±0.31＊ 3.62±0.74＊ 6.75±1.98＊ 7.25±1.83＊噁唑酮組 40 2.13±0.26 26.37±5.32 76.25±15.11 139.25±15.53 173.00±13.84

3 討 論

2009～2010年是脊髓水平瘙癢發病機制研究突飛猛進的2年，有研究發現，脊髓背角表達谷氨酸轉運體－2（glutamine transporter type 2，VGLUT－2）的神經元參與組胺依賴性和非組胺 依 賴 性 瘙 癢 的 介 導［11－12］；GRP／GRPR（gastin－releasing peptide，GRP；gastin－releasing peptide reportor，GRPR）介導了從外周到脊髓的瘙癢信號的轉導，并且認為GRPR可以作為瘙癢的脊髓標志物［13－14］，這些都提示，脊髓水平在瘙癢的發生過程中起著重要的作用。

最近研究發現，TLR7介導了氯喹引起的急性瘙癢［6］。TLR家族成員分享諸多下游信號通路，如MyD88作為TLR7和TLR4的共同下游分子參與了諸多病理、生理過程［8－9］。但TLR4是否也參與瘙癢過程尚有待研究。慢性瘙癢較急性瘙癢持續時間更長、危害更大，因此，研究慢性瘙癢的發病機制顯得更為重要和現實。小鼠頸背部皮膚局部反復涂抹噁唑酮可以誘發慢性皮炎、引起搔抓行為，成功復制慢性瘙癢模型，在每次涂抹噁唑酮后能產生在1h內較為嚴重的搔抓行為，此后溫和的搔抓可持續至少8h，并且模型較穩定［10，15］。因此，本研究采用上述模型，選取代表性時間點（－7d，激發后0、4、9、11 d），研究脊髓TLR4水平在慢性瘙癢過程中的表達變化。結果發現動物搔抓行為與脊髓TLR4表達呈正相關關系，相關系數r＝0.947。TLR7通過進一步激活下游信號通路參與急性瘙癢過程，但是在噁唑酮引起的瘙癢過程中TLR4是否也同樣是通過這些下游通路發揮作用尚需進一步的研究證實。

EGCG是綠茶中的一種黃酮類物質，作為TLR4的抑制劑已經成熟應用于TLR4相關的病理、生理過程的研究［16］。離體和體實驗均證實，EGCG可能是通過抑制TLR4激活，進而抑制TLR4下游信號的傳遞發揮藥理作用［17］。為進一步驗證脊髓TLR4參與了噁唑酮引起的慢性瘙癢過程，本研究從噁唑酮激發后第9天開始每8小時腹腔注射EGCG 1次，每次劑量（40mg／kg），直到第11天激發前，共計6次。結果發現，多次注射EGCG可以部分抑制而不能完全抑制噁唑酮引起的搔抓行為，說明還有其他機制參與噁唑酮引起的慢性瘙癢過程。

綜上所述，本研究成功復制了局部皮膚涂抹噁唑酮致慢性瘙癢模型，且發現脊髓TLR4表達水平與瘙癢行為相關，腹腔注射EGCG能抑制瘙癢行為和脊髓TLR4表達。脊髓TLR4參與了噁唑酮引起的慢性瘙癢過程，豐富了慢性瘙癢的發生機制，將為慢性瘙癢的治療帶來新的啟示。

［1］ Weisshaar E，Dalgard F.Epidemiology of itch：adding to the burden of skin morbidity［J］.Acta Derm Venereol，2009，89（4）：339－350.

［2］ Pisoni RL，Wikstrom B，Elder SJ，et al.Pruritus in haemodialysis patients：International results from the Dialysis Outcomes and Practice Patterns Study［J］.NDT Plus，2006，21（12）：3495－3505.

［3］ DeBalli P，Breen TW.Intrathecal opioids for combined spinalepidural analgesia during labour［J］.CNS drugs，2003，17（12）：889－904.

［4］ Ganesh A，Maxwell LG.Pathophysiology and management of opioid－induced pruritus［J］.Drugs，2007，67（16）：2323－2333.

［5］ Zucker I，Yosipovitch G，David M，et al.Prevalence and characterization of uremic pruritus in patients undergoing hemodialysis：uremic pruritus is still a major problem for patients with end－stage renal disease［J］.Am Acad Dermatol，2003，49（5）：842－846.

［6］ Liu T，Xu ZZ，Park CK，et al.Toll－like receptor 7mediates pruritus［J］.Nat Neurosci，2010，13（12）：1460－1462.

［7］ Ionescu MA，Baroni A，Brambilla L，et al.Double blind clinical trial in a series of 115patients with seborrheic dermatitis：prevention of relapses using a topical modulator of Toll like receptor 2［J］.G Ital Dermatol Venereol，2011，146（3）：185－189.

［8］ Akira S，Takeda K.Toll－like receptor signaling［J］.Nat Rev Immunol，2004，4（7）：499－511.

［9］ Yamamoto M，Sato S，Hemmi H，et al.Role of adaptor TRIF in the MyD88－independent toll－like receptor signaling pathway［J］.Sci Stke，2003，301（5633）：640－643.

［10］Tsukumo Y，Harada D，Manabe H.Pharmacological characterization of itch－associated response induced by repeated application of oxazolone in mice［J］.Pharmacol Sci，2010，113（3）：255－262.

［11］Liu Y，Abdel Samad O，Zhang L，et al.VGLUT2－dependent glutamate release from nociceptors is required to sense pain and suppress itch［J］.Neuron，2010，68（3）：543－556.

［12］Lagerstrom MC，Rogoz K，Abrahamsen B，et al.VGLUT2－dependent sensory neurons in the TRPV1population regulate pain and itch［J］.Neuron，2010，68（3）：529－542.

［13］Sun YG，Zhao ZQ，Meng XL，et al.Cellular basis of itch sensation［J］.Science，2009，325（5947）：1531－1534.

［14］Sun YG，Chen ZF.A gastrin－releasing peptide receptor mediates the itch sensation in the spinal cord［J］.Nature，2007，448（7154）：700－703.

［15］Tsukumo Y，Matsumoto Y，Miura H，et al.Gabapentin and pregabalin inhibit the itch－associated response induced by the repeated application of oxazolone in mice［J］.Pharmacol Sci，2011，115（1）：27－35.

［16］Hong Byun E，Fujimura Y，Yamada K，et al.TLR4signaling inhibitory pathway induced by green tea polyphenol epigallocatechin－3－gallate through 67－kDa laminin receptor［J］.Immunology，2010，185（1）：33－45.

［17］Kuang X，Huang Y，Gu HF，et al.Effects of intrathecal epigallocatechin gallate，an inhibitor of Toll－like receptor 4，on chronic neuropathic pain in rats［J］.Eur J Pharmacol，2012，676（1／3）：51－56.