普伐他汀對(duì)酒精性股骨頭壞死干預(yù)作用的實(shí)驗(yàn)研究＊

黃 可，唐毓金

（1.桂林醫(yī)學(xué)院研究生學(xué)院2010級(jí)，廣西 桂林 541004；2.右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院脊柱骨病外科，廣西 百色 533000）

缺血性股骨頭壞死分為創(chuàng)傷性和非創(chuàng)傷性，非創(chuàng)傷性股骨頭壞死（nontraumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH）的主要原因?yàn)榧に睾鸵掖颊T發(fā)多見。國內(nèi)外對(duì)乙醇可引起股骨頭壞死報(bào)道較多，其發(fā)生可能與過量飲酒導(dǎo)致的肝臟細(xì)胞損傷、脂質(zhì)代謝紊亂、血液高凝狀態(tài)、乙醇所致的骨細(xì)胞凋亡及微血管內(nèi)皮細(xì)胞損害有關(guān)［1－3］。本研究觀察降脂藥物普伐他汀，對(duì)家兔酒精性股骨頭壞死（alcohol－induced osteonecrosis of the femoral head，AOFH）的預(yù)防作用，以探索一種對(duì)長期飲酒人群有效預(yù)防AOFH的方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料 健康成年中國家兔30只，體質(zhì)量1.5～2.0kg（右江民族醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）。采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組。實(shí)驗(yàn)組12只，采用灌胃法，給予烈性白酒（乙醇含量50%）10mL·kg－1·d－1，同時(shí)給予普伐他汀2mg·kg－1·d－1口服。模型組12只，采用灌胃法，給予烈性白酒（乙醇含量50%）10mL·kg－1·d－1。對(duì)照組6只，不予任何處理。各組動(dòng)物分籠飼養(yǎng)，自由取食、飲水，12周后空氣栓塞處死。

1.2 血液學(xué)檢查 血脂檢查：采用日立7600型生化分析儀分別測定血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、高 密 度 脂 蛋 白 （high－density lipoprotein，HDL）、低密度脂蛋白（low－density lipoprotein，LDL）、極低密度脂蛋白（very low－density lipoprotein，VLDL）；血液黏度檢查：采用血流變自動(dòng)檢測儀測定血漿黏度、全血高切還原黏度、全血低切還原黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、全血高切相對(duì)指數(shù)、全血低切相對(duì)指數(shù)、紅細(xì)胞變形指數(shù)、血小板黏附率。

表1 實(shí)驗(yàn)前、后各組血脂指標(biāo)檢測結(jié)果

表1 實(shí)驗(yàn)前、后各組血脂指標(biāo)檢測結(jié)果

＊：P＜0.05，與同期模型組比較；△：P＜0.05，與同期對(duì)照組比較；▲：P＜0.05，與實(shí)驗(yàn)前同組比較。

組別 n 時(shí)間TC TG HDL LDL VLDL實(shí)驗(yàn)組 12 實(shí)驗(yàn)前 1.21±0.40 0.83±0.23 0.47±0.11 0.33±0.25 0.45±0.15模型組 12 1.34±0.34 1.10±0.32 0.62±0.22 0.27±0.16 0.44±0.08對(duì)照組 6 1.16±0.17 0.97±0.21 0.46±0.15 0.26±0.14 0.46±0.10實(shí)驗(yàn)組 12 實(shí)驗(yàn)后 1.60±0.47＊ 0.92±0.62＊ 0.61±0.26＊ 0.46±0.28＊ 0.46±0.28＊模型組 12 2.58±0.66△▲ 2.52±1.43△▲ 0.39±0.14△▲ 0.94±0.47△▲ 0.75±0.25△▲對(duì)照組 6 1.20±0.34 0.84±0.34 0.45±0.08 0.27±0.17 0.47±0.20

1.3 組織病理學(xué)檢查 家兔采用空氣栓塞處死，取肝臟標(biāo)本，置于10%中性甲醛溶液中固定24h，做常規(guī)石蠟切片，HE染色觀察。取股骨頭標(biāo)本置于10%中性甲醛溶液固定48h，后置于Plank－Rychlo液脫鈣2周，常規(guī)石蠟包埋，制成厚4μm切片，常規(guī)HE染色，置光學(xué)顯微鏡下觀察。股骨頭壞死發(fā)生率計(jì)算：根據(jù)光學(xué)顯微鏡下HE染色觀察，股骨頭壞死發(fā)生率＝各組觀察到存在壞死的動(dòng)物數(shù)／本組動(dòng)物數(shù)×100%。

1.4 透射電鏡細(xì)胞微觀察 每組取2只家兔空氣栓塞處死，在股骨頭軟骨下2～3mm處取2mm×2mm×2mm骨塊，3%戊二醛4℃環(huán)境下固定24h，10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）4℃環(huán)境下脫鈣8周，1%鋨酸后固定，常規(guī)包埋切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料以表示，單組樣本前、后比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，試驗(yàn)后樣本比較采用方差分析，股骨頭壞死發(fā)生率的比較采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

試驗(yàn)中因誤吸及肺部感染致實(shí)驗(yàn)組家兔死亡1只。

2.1 血脂成分分析結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組TC、TG、HDL、LDL、VLDL改變差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；模型組TC、LDL較實(shí)驗(yàn)前明顯升高（P＜0.05）、HDL較實(shí)驗(yàn)前明顯降低（P＜0.05）、TG、VLDL較實(shí)驗(yàn)前升高（P＜0.05）；對(duì)照組各項(xiàng)指標(biāo)與實(shí)驗(yàn)組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)組 TC、TG、HDL、LDL、VLDL與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

2.2 血液流變學(xué)分析結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，實(shí)驗(yàn)組全血高切還原黏度、全血高切相對(duì)指數(shù)及全血低切相對(duì)指數(shù)較實(shí)驗(yàn)前升高（P＜0.05）。模型組血漿黏度、全血高切還原黏度、全血低切還原黏度、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、血小板黏附率、全血低切相對(duì)指數(shù)較實(shí)驗(yàn)前升高（P＜0.05）。模型組血漿黏度、全血高切還原黏度、全血低切還原黏度及紅細(xì)胞聚集指數(shù)與實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 組織病理學(xué)觀察

2.3.1 肝臟 光學(xué)顯微鏡下模型組家兔肝細(xì)胞見明顯的脂肪顆粒，在肝細(xì)胞內(nèi)聚集成氣球樣變性，部分肝細(xì)胞發(fā)生凝固性壞死，周圍炎性細(xì)胞浸潤。實(shí)驗(yàn)組見肝細(xì)胞輕度水腫。對(duì)照組未見明顯的病理學(xué)改變。

2.3.2 股骨頭 肉眼見模型組家兔股骨頭表面失去光澤，未見軟骨凹陷及明顯的壞死改變，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組形態(tài)無變化。光學(xué)顯微鏡下，模型組骨髓細(xì)胞可見明顯凝固性壞死，髓內(nèi)骨髓細(xì)胞減少，脂肪組織增多，脂肪細(xì)胞肥大，骨小梁鈣質(zhì)脫失、疏松，部分骨小梁崩裂，空骨陷窩增多；實(shí)驗(yàn)組鏡下病理改變較模型組輕微；對(duì)照組未見鏡下改變（圖1）。

2.3.3 骨細(xì)胞 模型組透射電鏡下觀察家兔骨細(xì)胞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)消失，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器溶解，細(xì)胞核膜不清、核固縮，僅留下細(xì)胞輪廓；實(shí)驗(yàn)組骨細(xì)胞微觀改變不明顯，與對(duì)照組比較基本無變化（圖2）。

2.3.4 股骨頭壞死發(fā)生率 實(shí)驗(yàn)組、模型組及對(duì)照組股骨頭壞死發(fā)生率分別為9.1%（1／11）、83.3%（10／12）和0（0／6）。模型組與實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 光學(xué)顯微鏡下家兔股骨頭組織（×200）

圖2 透射電鏡下3組家兔骨細(xì)胞（×15 000）

表2 3組家兔實(shí)驗(yàn)前、后血液流變學(xué)檢測結(jié)果

表2 3組家兔實(shí)驗(yàn)前、后血液流變學(xué)檢測結(jié)果

＊：P＜0.05，與同期模型組比較；△：P＜0.05，與同期對(duì)照組比較；▲：P＜0.05，與實(shí)驗(yàn)前同組比較。

組別 n 時(shí)間 血漿黏度（mPa.s）全血高切還原黏度（mPa.s）全血低切還原黏度（mPa.s）紅細(xì)胞聚集指數(shù)全血高切相對(duì)指數(shù)全血低切相對(duì)指數(shù)紅細(xì)胞變形指數(shù)血小板黏附率（%）實(shí)驗(yàn)組 12 實(shí)驗(yàn)前 1.26±0.13 5.04±1.08 32.96±10.46 4.54±0.60 2.24±0.28 10.09±1.29 0.81±0.15 36.67±0.59模型組 12 1.25±0.12 5.53±1.18 31.09±4.83 4.00±0.29 2.92±0.58 11.65±2.38 0.80±0.09 36.13±0.29對(duì)照組 6 1.26±0.11 4.98±0.90 29.93±1.99 4.12±0.13 2.73±0.64 11.25±2.68 0.76±0.06 36.25±0.13實(shí)驗(yàn)組 12 實(shí)驗(yàn)后 1.26±0.05＊ 6.07±0.59＊▲△ 41.72±3.84＊▲△ 4.66±0.24＊△ 2.67±0.26▲ 12.47±1.56＊▲ 0.87±0.04△ 36.79±0.24△模型組 12 1.43±0.13▲△ 6.84±0.41▲△ 47.58±4.04▲△ 5.07±0.36▲△ 3.00±0.40 14.82±2.34▲△ 0.86±0.05△ 37.07±0.44▲△對(duì)照組 6 1.24±0.15 5.36±0.37 29.81±1.33 3.98±0.17 2.93±0.39 11.68±1.62 0.79±0.09 36.11±0.17

3 討 論

3.1 普伐他汀可以防止乙醇引起的股骨頭壞死 酒精性股骨頭壞死的發(fā)生機(jī)制尚不清楚，研究認(rèn)為是由多種因素綜合作用的結(jié)果。乙醇可導(dǎo)致高脂血癥、脂肪肝和脂質(zhì)代謝紊亂，股骨頭髓內(nèi)脂肪細(xì)胞肥大，骨細(xì)胞凋亡［4－6］。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組家兔TC、TG、LDL較實(shí)驗(yàn)前明顯升高、HDL較實(shí)驗(yàn)前明顯降低，VLDL較實(shí)驗(yàn)前升高。對(duì)照組并無上述改變。此結(jié)果與相關(guān)學(xué)者關(guān)于酒精性股骨頭壞死，脂代謝紊亂的結(jié)果相似［7－8］。另外，病理檢查發(fā)現(xiàn)模型組有83%（10／12）的家兔發(fā)生了不同程度的骨小梁塌陷、崩解、骨細(xì)胞死亡等，而同期實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明降脂藥普伐他汀對(duì)乙醇所致股骨頭壞死的發(fā)生有預(yù)防作用。

3.2 普伐他汀能抑制血小板聚集，防止骨壞死 長期飲酒可出現(xiàn)血液高凝狀態(tài)、血栓形成，導(dǎo)致骨髓腔內(nèi)血流減少，引起缺血、壞死。帥波等［9］研究發(fā)現(xiàn)，NONFH患者血小板顆粒數(shù)量及血小板表面膜糖蛋白GPⅡb／Ⅲa（PAC－1）活化率明顯增高。這些物質(zhì)在介導(dǎo)血小板活化及血栓形成的過程中起重要作用［10］。本研究發(fā)現(xiàn)，給予家兔高濃度乙醇灌胃3個(gè)月后，其血漿黏度、全血高切還原黏度、全血低切還原黏度、血小板黏附率、紅細(xì)胞聚集指數(shù)明顯增加，與實(shí)驗(yàn)前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。說明大量活化的血小板刺激血液高凝狀態(tài)產(chǎn)生，最終導(dǎo)致血栓形成，引起骨缺血、骨壞死［11］。實(shí)驗(yàn)組的家兔預(yù)防性口服普伐他汀片，發(fā)現(xiàn)其血小板黏附率、紅細(xì)胞聚集指數(shù)、血漿黏度、全血高切還原黏度、全血低切還原黏度稍有升高，但與實(shí)驗(yàn)前比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明普伐他汀可抑制乙醇引起的血小板活化，從而抑制血小板聚集及血栓形成，防止骨壞死。

3.3 普伐他汀可防止乙醇對(duì)骨細(xì)胞的損害 乙醇對(duì)骨組織的毒性作用可直接引起股骨頭壞死［12－13］。有研究發(fā)現(xiàn)，缺血性股骨頭壞死的血管再生和新骨形成的能力明顯減弱。乙醇可刺激股骨頭局部血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白mRNA表達(dá)降低，引起股骨頭壞死［14］。王維軍等［15］研究認(rèn)為，大量飲酒后可見股骨頭內(nèi)骨細(xì)胞減少、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖活性降低及分化方向改變，骨化減少，導(dǎo)致骨壞死。本研究發(fā)現(xiàn)，光學(xué)顯微鏡下模型組骨小梁鈣質(zhì)明顯脫失、稀疏，部分骨小梁崩解，骨髓內(nèi)骨細(xì)胞密度顯著降低，髓內(nèi)脂肪細(xì)胞明顯增多。透射電鏡下觀察見模型組動(dòng)物骨細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)消失，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器溶解，細(xì)胞核膜不清、核固縮，僅留下細(xì)胞輪廓。對(duì)照組并無上述改變。說明乙醇可刺激骨細(xì)胞凋亡，引起股骨頭壞死。同期實(shí)驗(yàn)組骨細(xì)胞并無明顯改變。說明普伐他汀能夠在一定程度上預(yù)防乙醇引起的骨細(xì)胞凋亡、壞死，防止股骨頭壞死。

綜上所述，本研究采用普伐他汀可有效預(yù)防乙醇引起的家兔高脂血癥、降低血小板活化及紅細(xì)胞聚集，防止小血管栓塞，防止乙醇引起的骨細(xì)胞凋亡，對(duì)酒精性股骨頭壞死的發(fā)生有一定的預(yù)防作用。

［1］ Shapiro F，Connolly S，Zurakowski D，et al.Femoral head deformation and repair following induction of ischemic necrosis：a histologic and magnetic resonance imaging study in the piglet［J］.J Bone Joint Surg Am，2009，91（12）：2903－2914.

［2］ 王少華，王義生，李月白.siRNA腺病毒載體預(yù)防兔酒精性股骨頭壞死的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國骨與關(guān)節(jié)外科，2010，3（1）：62－67.

［3］ 王大偉，史寶明，張爽.構(gòu)建酒精性股骨頭壞死動(dòng)物模型理論依據(jù)及造模方法［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2010，14（50）：9413－9416.

［4］ Wang Y，Yin L，Li Y，et al.Preventive effects of puerarin on alcohol－induced osteonecrosis［J］.Clin Orthop Relat Res，2008，466（5）：1059－1067.

［5］ 孫偉，王佰亮，李子榮，等.酒精性股骨頭壞死股骨干骺端骨髓間質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞周期的變化［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2008，12（3）：469－472.

［6］ Suh KT，Kim SW，Roh HL，et al.Decreased osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells in alcohol－induced osteonecrosis［J］.Clin Orthop Relat Res，2005（431）：220－225.

［7］ 石少輝，李子榮，孫偉，等.酒精性和激素性股骨頭壞死的發(fā)病與脂質(zhì)代謝［J］.中國組織工程研究與臨床康復(fù)，2011，15（17）：3217－3220.

［8］ Glueck CJ，F(xiàn)reiberg RA，Boppana S，et al.Thrombophilia，hypofibrinolysis，the eNOST－786Cpolymorphism，and multifocal osteonecrosis［J］.Bone Joint Surg Am，2008，90（10）：2220－2229.

［9］ 帥波，沈霖，楊艷萍，等.股骨頭缺血性壞死患者血小板微顆粒及血小板膜糖蛋白GPⅡb／Ⅲa、P選擇素表達(dá)的相關(guān)性研究［J］.中國矯形外科雜志，2010，18（13）：1107－1110.

［10］Kang P，Shen B，Yang J，et al.Circulating platelet－derived microparticles may be a potential cause of microthrombosis in patients with osteonecrosis of the femoral head［J］.Thromb Res，2008，123（2）：367－373.

［11］Jones JP.Alcoholism，hypercortisonism，fat embolism and osseous avascular necrosis［J］.Clin Orthop Relat Res，2001（393）：4－12.

［12］Calder JD，Buttery L，Revell PA，et al.Apoptosis－－a significant cause of bone cell death in osteonecrosis of the femoral head［J］.J Bone Joint Surg Br，2004，86（8）：1209－1213.

［13］Segin C，Kassis J，Busque L，et al.Non－traumatic necosis of bone osteonecrosis is associated with endothelial cellactivation but not thrombophilia［J］.Rheumatology，2008，47（6）：1151－1155.

［14］Gong Z，Wenzeman FH.Inhibitory effect of alcohol on osteogenic differentiation in human bone marrow－derived messenchymal stem cells［J］.Alcolhol Clin Exp Res，2004，28（3）：468－479.

［15］王維軍，李嗣生，牛東生，等.股骨頭缺血性壞死骨質(zhì)含量與 VEGF、bFGF、BMP－2mRNA表達(dá)的相關(guān)性研究［J］.中國修復(fù)重建外科雜志，2011，25（8）：984－991.