石油－重金屬?gòu)?fù)合污染土壤的微生物修復(fù)研究

高憲雯，成杰民，陳雪蘭，高 佳

（山東師范大學(xué)·人口資源與環(huán)境學(xué)院，山東 濟(jì)南 250014）

1 引言

石油號(hào)稱“工業(yè)的血液”，是重要的工業(yè)原料，同時(shí)又是燃料與能源。隨著工業(yè)化的不斷發(fā)展，全球石油用量不斷增加，使得開采面積不斷擴(kuò)大。目前每年世界石油的總產(chǎn)量近30億t，由于意外事故或管理不當(dāng)，在開采、運(yùn)輸、貯藏、加工過程中，約有近800萬(wàn)t石油污染物進(jìn)入環(huán)境，其中大部分污染物進(jìn)入到土壤中［1］。土壤石油污染已經(jīng)成為一個(gè)全球性的、突出的環(huán)境問題。我國(guó)目前每年有近60萬(wàn)t石油污染物進(jìn)入環(huán)境，有近10萬(wàn)t石油污染土壤有待解決［2］。東北、華北、華南、華東、西北不同地理位置和氣候特征的油田區(qū)土壤均受到了不同程度的石油污染，含油率最高可達(dá)到23%［3］。而大慶、遼河等油田的重污染區(qū)的土壤表層（0～20cm）的含油量更是高達(dá)30%～50%［4］。土壤石油污染問題已經(jīng)成為我國(guó)可持續(xù)發(fā)展所面臨的重要問題。

在鉆井廢棄物的毒性檢測(cè)工作中，一些常見的具有危害性的金屬幾乎全部檢到了蹤跡，如Zn、Pb、Cu、Cd、Ni、Hg、As、Ba、Cr等。葉雅文認(rèn)為，這些金屬元素可能是伴隨開采過程中鉆井液添加劑、基礎(chǔ)添加材料（如低品質(zhì)的重晶石）進(jìn)入體系的，也可能是隨鉆屑由地層中攜帶出來的。大多數(shù)重金屬的致毒濃度均較低，如Cd的致毒濃度為0.2μg／L，而油田廢水中Cd的平均含量可達(dá)到2.7μg／L［5］。因此，石油－重金屬?gòu)?fù)合污染問題亟待解決。

石油污染土壤的修復(fù)方法主要有物理、化學(xué)、生物和綜合修復(fù)方法，而生物修復(fù)方法費(fèi)用低、對(duì)環(huán)境影響小、無(wú)二次污染、不破壞土壤環(huán)境，因此采用生物方法來修復(fù)石油污染土壤。土壤微生物修復(fù)是利用土壤中微生物的代謝作用將土壤中有害的污染物降解為無(wú)害物質(zhì)的過程。土壤微生物修復(fù)技術(shù)是利用土壤中原有的土著微生物或者向土壤中投加的已經(jīng)馴化好的微生物，并在原有的土壤生態(tài)環(huán)境中添加適當(dāng)?shù)臓I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，分解和轉(zhuǎn)化有機(jī)污染物，加快修復(fù)污染土壤。

本文以山東省黃河三角洲孤島油區(qū)石油污染土壤為研究對(duì)象，通過測(cè)定不同時(shí)期的土壤脫氫酶活性、微生物生物量碳、石油烴濃度及降解率來研究微生物在石油－重金屬?gòu)?fù)合污染土壤修復(fù)過程中的作用，對(duì)石油－重金屬?gòu)?fù)合污染土壤的修復(fù)，具有重要理論作用和實(shí)踐意義。

2 材料與方法

2.1 材料

供試土壤:采自山東省東營(yíng)市孤島油區(qū)典型的石油－重金屬?gòu)?fù)合污染的耕層土壤（0～20cm），經(jīng)風(fēng)干磨細(xì)過20目篩備用。

供試儀器:電子天平、紫外－可見分光光度計(jì)、干燥器、真空泵、振蕩器、離心機(jī)、恒溫加熱消煮爐、超聲波器。

供試試劑:實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

供試菌種:來自山東省科學(xué)院前期研究所篩選出的石油降解菌。

2.2 研究方法

稱取0.5kg過20目篩的風(fēng)干土于塑料缽中，選擇2種重金屬（Cd、Ni），設(shè) Cd濃度為 0、2.5、5、10、15、20 mg／kg，設(shè) Ni濃度為0、25、50、100、150、200mg／kg，配置模擬污染土，每種處理設(shè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組，每組重復(fù)3次，在室內(nèi)培養(yǎng)60d，重金屬在土壤中的各形態(tài)分配達(dá)平衡后備用。

將石油烴溶解后加入土壤并充分混合，施加石油烴濃度達(dá)到2000mg／kg，實(shí)驗(yàn)組施加40mg／kg的石油降解菌劑，對(duì)照組不施加，混勻后裝盆，共66盆，并保持土壤水分在田間持水量的60%～70%，以備測(cè)定。

分別測(cè)定土壤在7d、15d、30d、45d、60d的脫氫酶活性、微生物量碳、石油烴含量來研究微生物在石油－重金屬?gòu)?fù)合污染土壤修復(fù)過程中的作用。

2.3 分析方法

2.3.1 脫氫酶活性的測(cè)定

采用TTC（氯化三苯基四氮唑）分光光度法［6］。

（1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。配置溶液濃度分別為0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7mg／mL的 TTC標(biāo)準(zhǔn)溶液，取8支具塞比色管，分別依次加入2mLTris－HCl緩沖溶液（pH＝7.6）、2mL去離子水和0.4mL不同濃度的TTC標(biāo)準(zhǔn)溶液。然后分別加入2mL的50mg／mL的Na2S溶液，振蕩搖勻。反應(yīng)20min，待充分顯色后，加入5mL甲苯，振蕩萃取微紅色的TPF，過濾后上清液于485nm處測(cè)定吸光度值。以TPF的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度A值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）土樣測(cè)定。分別取5g新鮮土壤樣品于塑料瓶中，每個(gè)塑料瓶加入2mL 1%TTC溶液，2mLTris－HCl緩沖溶液（pH＝7.6），2mL 1%葡萄糖，充分混勻。置于37℃恒溫箱中避光培養(yǎng)20h。培養(yǎng)結(jié)束后，加入5mL甲苯，劇烈震蕩1min，后靜置5min，再振蕩30s，然后靜置5min。將塑料瓶中的物質(zhì)經(jīng)0.45微米有機(jī)濾膜過濾到比色管中，并用少量的甲苯洗滌塑料瓶2～3次，定容到25mL，于485nm下測(cè)定吸光度值A(chǔ)，以每克干土每小時(shí)生成的TPF為脫氫酶的一個(gè)活性單位。

（3）計(jì)算公式:

CTPF為TPF 的濃度（μg／mL），W 為烘干土質(zhì)量（g）。

2.3.2 微生物生物量碳的測(cè)定

采用熏蒸提取－容量分析法。

（1）熏蒸。稱取10g新鮮土壤三份，置于50mL小燒杯中，放于真空干燥器內(nèi)，并放置盛有去乙醇氯仿（約2／3燒杯）的小燒杯2只，燒杯內(nèi)放入少量沸石，同時(shí)放入一小燒杯稀NaOH溶液以吸收熏蒸期間釋放的CO2，干燥器底部加入少量的水以保持濕度。連接真空泵，將真空度控制在－0.07MPa以下，使氯仿劇烈沸騰3～5min，關(guān)閉真空干燥器閥門，在25℃暗室放置24h。熏蒸結(jié)束后，取出氯仿和NaOH溶液的燒杯，清潔干燥器，反復(fù)抽真空（－0.07MPa；5～6次，每次3min），直到土壤無(wú)氯仿味為止。熏蒸的同時(shí)，另稱取等量的土壤3份，置于另一干燥器中但不熏蒸，作為對(duì)照土壤。

（2）提取。將熏蒸土壤轉(zhuǎn)移到100mL塑料瓶中，加入40mL 0.5mol／L的K2SO4溶液，振蕩30min，用中速定量濾紙過濾到塑料瓶中，同時(shí)向?qū)φ胀寥乐兄苯蛹尤?0mL 0.5mol／L的K2SO4溶液提取，并作無(wú)土壤空白。

（3）測(cè)定。吸取10mL上述土壤提取液于消化管中，準(zhǔn)確加入10mL 0.018mol／L K2Cr2O7－12mol／L H2SO4溶液，再加入少量的沸石，混勻后置于恒溫加熱消煮爐中，于175℃煮沸10min，冷卻后轉(zhuǎn)移到100mL錐形瓶中，用去離子水洗滌消化管3～5次，使溶液體積約為50mL，加入一滴鄰菲羅啉指示劑，用0.05mol／L FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，溶液顏色由橙黃色變?yōu)樗{(lán)綠色，再變?yōu)樽丶t色為滴定終點(diǎn)。

（4）計(jì)算公式:

M 為FeSO4溶液濃度（mol／L）；V0為空白消耗的FeSO4溶液體積（mL）；V為樣品消耗的FeSO4溶液體積（mL）；f為稀釋倍數(shù)；w 為烘干土質(zhì)量（g）。

土壤微生物生物量碳:

Ec為熏蒸與未熏蒸土壤的差值；kEC為換算系數(shù)；取值為0.38。

2.3.3 石油烴含量的測(cè)定

采用超聲提取－紫外分光光度法［7］。

（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。取0.1g標(biāo)準(zhǔn)油，用CCl4稀釋定容于100mL容量瓶中，制成1mg／mL的石油標(biāo)準(zhǔn)使用液，取8支25mL容量瓶，分別取0、1、2、3、4、5、6、7mL石油標(biāo)準(zhǔn)使用液，用CCl4定容，于260nm處測(cè)定吸光度，以石油烴濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（2）土樣測(cè)定。精確稱取干燥試樣10.00g于50mL離心管中，加人10mL四氯化碳，置于超聲波器水浴中超聲提取15min，靜止過濾到25mL比色管中，再用10mL四氯化碳重復(fù)一遍上述操作，再用四氯化碳定容到25mL，在波長(zhǎng)260nm處測(cè)定吸光度值。

（3）計(jì)算公式:

C石油烴為石油烴濃度（mg／mL）；W 為烘干土質(zhì)量（g）。

3 結(jié)果與討論

3.1 土壤石油降解變化

在微生物修復(fù)石油－重金屬污染土壤過程中，土壤的石油烴降解速率隨時(shí)間變化見圖1～圖4，Cd污染土壤與Ni污染土壤在微生物修復(fù)條件下，石油烴降解速率先隨時(shí)間變化增大，在15d時(shí)達(dá)到最大值，隨后隨時(shí)間降解速率降低。對(duì)照組呈現(xiàn)的石油烴降解速率變化規(guī)律與實(shí)驗(yàn)組類似，在15d時(shí)達(dá)到最大降解速率，但實(shí)驗(yàn)組降解速率明顯高于對(duì)照組降解速率。在15d時(shí)，25mg／kg Ni污染土壤實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組降解速率高0.45%／d。且隨著重金屬濃度的升高，石油烴降解速率降低，重金屬污染影響了微生物降解石油烴的效率。

圖1 Ni土壤對(duì)照組石油降解速率隨時(shí)間變化

圖2 Ni污染土壤實(shí)驗(yàn)組石油烴降解速率隨時(shí)間變化

圖3 Cd污染土壤對(duì)照組石油烴降解速率隨時(shí)間變化

圖4 Cd污染土壤實(shí)驗(yàn)組石油烴降解速率隨時(shí)間變化

土壤石油烴降解率隨重金屬濃度變化結(jié)果見圖5，結(jié)果表明:污染土壤的石油降解率均隨重金屬濃度增大而降低，且實(shí)驗(yàn)組石油降解率明顯高于對(duì)照組:對(duì)照組培養(yǎng)60d后的土壤的石油降解率，Cd污染土壤為17.86%、Ni污染土壤為16.08%；實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)60d后的污染土壤的石油降解率，Cd污染土壤為44.27%、Ni污染土壤為44.03%。

3.2 土壤微生物活性變化

土壤脫氫酶活性與土壤微生物量碳可以反映土壤中微生物的活性，15d時(shí)土壤脫氫酶活性隨重金屬變化結(jié)果見圖6，隨重金屬濃度增大，土壤脫氫酶活性降低，15d時(shí)土壤微生物量碳隨重金屬濃度變化結(jié)果見圖7，隨重金屬濃度增大，土壤中微生物量碳量降低。土壤脫氫酶活性與微生物量碳都隨著重金屬濃度的升高而降低，因而土壤中微生物的活性受土壤中重金屬濃度的影響，從而影響微生物對(duì)石油烴的降解效率。分析認(rèn)為，重金屬對(duì)土壤中的微生物具有抑制或毒害作用。

圖5 土壤總石油烴降解率隨重金屬濃度變化

圖6 土壤脫氫酶活性隨重金屬濃度變化

圖7 土壤微生物量碳隨重金屬濃度變化

4 結(jié)語(yǔ)

本文以山東省黃河三角洲孤島油區(qū)石油污染土壤為研究對(duì)象，通過添加降解菌，利用微生物修復(fù)技術(shù)修復(fù)石油－重金屬?gòu)?fù)合污染土壤，可以達(dá)到降解土壤中石油烴濃度的目的。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，添加降解菌可以提高土壤中的微生物活性，從而提高土壤中石油降解率，在添加降解菌培養(yǎng)60d后，添加降解菌的實(shí)驗(yàn)組和未添加降解菌的對(duì)照組石油烴平均降解率分別為45.60%和17.57%。在石油重金屬?gòu)?fù)合污染中，重金屬濃度影響了土壤中降解菌的降解效果，土壤中的脫氫酶含量與微生物量碳都隨著重金屬濃度的增大而降低，石油烴的降解率也隨之降低，說明重金屬對(duì)石油降解菌具有抑制或毒害作用。因而在石油－重金屬?gòu)?fù)合污染土壤中，考慮重金屬的去除或鈍化，對(duì)石油污染修復(fù)有著重要意義。

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