質譜成像分析結腸癌組織壞死過程中蛋白的變化

王麗麗，陳達鑫，詹友知，蔡巧燕，莊群川，彭 軍

（福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建 福州350122）

基于基質輔助激光誘導解析-飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption-ionization of flighttime mass spectrometry，MALDI-TOF）構成的生物質譜的組織成像技術（mALDI-imaging mass spectrometry，MALDI-IMS）是一門新興的分子成像技術。與其他成像技術相比，MALDI IMS技術不需要任何分離或純化的靶分子，不僅能夠監測未知的分子，而且可對眾多分子的空間分布進行定位。許多研究者證實，MALDI-IMS是一項發展極為迅速的研究方法［1］，可在大范圍的組織樣品中研究分子種類的分布［2］。MALDI IMS已用于直接探測薄組織切片中的蛋白質、多肽、脂類和小分子類物質的分布［3，4］，已廣泛用于疾病進展和相關生物標記物的探測［5-8］。本文利用MALDI-IMS技術對結腸癌組織切片進行了分析，以探討相關蛋白的變化，為結腸癌相關的研究提供參考。

1 材 料

1.1 材料 導電載玻片（美國布魯克道爾頓公司）；結腸癌HT-29細胞株購自上海中科院細胞庫；SPF級裸鼠購自上海斯萊克實驗動物中心，合格證號：SCXK（滬）2012-0002。

1.2 試劑 無水乙醇、MTT（西格瑪奧德里奇中國分公司）；DMEM培養基、胰蛋白酶、胎牛血清（美國賽默飛世爾公司）。

1.3 主要儀器 冷凍切片機（德國徠卡有限公司）；真空干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；掃描儀（臺灣Umax Co.）；ImagePrep、MALDI-TOF（美國布魯克道爾頓公司）。

2 方 法

2.1 細胞培養及動物實驗 將市購人結腸癌細胞株HT-29置于含10%熱滅活胎牛血清（FBS）的RPM-1640培養液中，在37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養箱中培養。細胞單層貼壁生長，至80%～90%融合時以0.25%胰蛋白酶和EDTA消化傳代培養。1.5×106的細胞與基質膠1∶1混合后于無菌條件下種植于裸鼠右側胸壁第二乳墊脂肪層下，觀察腫瘤的生長。待腫瘤中間壞死時，將裸鼠麻醉后取出腫瘤。

2.2 樣品的收集和保存 取下的腫瘤組織用PBS將血沖洗干凈，用錫箔紙將組織包好在-20℃冷凍30 min后，放于-80℃保存。

2.3 MALDI IMS腫瘤組織冷凍切片后轉移到導電的載玻片上，切片用70%乙醇和100%乙醇浸洗。真空干燥后，利用ImagePrep工作站以均勻噴上芥子酸基質（10mg/mL，乙腈∶水∶三氟乙酸＝60∶40∶0.2）。

2.4 數據分析 采用FlexImaging 3.0軟件進行數據采集后，用ClinProTools 2.2軟件進行數據分析。

3 結 果

新鮮的冷凍切片組織按照2.3進行處理后，用掃描儀成像，結果見圖1A。實驗中對整個組織切片進行質譜分析，并根據組織切片壞死的位置，選取腫瘤正常部位（ROI 1）與腫瘤壞死部位（ROI 2）進行差異分析，見圖1。

ROI 1部分的平均質譜圖和ROI 2部分的平均質譜圖見圖2，從圖中可以看出：3348Da和6277Da的蛋白差異比較大。3348Da的蛋白在正常腫瘤組織中高于壞死部分；反之，6277Da的蛋白在腫瘤壞死部分高于正常部分。這2種差異蛋白在腫瘤切片組織中的分布見圖1B。

4 討 論

結腸癌（CRC）是世界上最常見的胃腸道腫瘤，其發病率和死亡率在全部惡性腫瘤中排第3位［9］。結腸癌5a生存率雖明顯增高，但確診時在伴有遠處轉移的患者中，5a生存率僅有8%［10］。癌癥能否得到有效地治療及治愈取決于是否能夠在癌癥早期階段對其進行及時地檢測。生物標志物作為最直接快速有效的診斷手段，其篩選與獲得可在腫瘤診斷、發展、治療以及療效監測等多個方面發揮重要的作用，因此成為研究的熱點及重點。由于MALDI IMS技術不需要事先知道靶分子的信息，不僅能夠監測未知的分子，而且可對眾多分子的空間分布進行定位，因此為快速獲得及篩選生物標志物帶來了極大的可能。

圖1 腫瘤切片的掃描圖（A）和MALDI IMS圖（B）

圖2 腫瘤正常部位（ROI 1）和腫瘤壞死部位（ROI 2）質譜圖

本文采用部分壞死的結腸癌組織切片作為研究對象，從腫瘤正常部位（ROI 1）和腫瘤壞死部位（ROI 2）質譜圖（圖2）比較中，可以看出3348Da和6277Da 2種蛋白在腫瘤正常部位和壞死部位差異比較大。圖1B顯示了這2種差異蛋白的空間分布，從圖中可以看出：3348Da的蛋白主要分布在正常腫瘤組織中，而6277Da的蛋白主要分布在腫瘤壞死的部位。因此，MALDI IMS結果顯示6277Da的蛋白可以作為結腸癌腫瘤組織壞死的生物標志物。

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