不同海拔高山植物美麗風毛菊生理生化特性的研究

朱鵬錦，楊 莉，師生波，韓 發

（1.廣西壯族自治區亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530000；2.中國科學院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008）

1 引言

美麗風毛菊（Saussureapulchra）為多年生草本植物，主要分布于青海、西藏和甘肅等部分地區，生長在海拔1900～4600m的山坡草地、灘地、高寒草甸，是典型的高山植物[1]。其根可入藥，味苦、辛，性寒，有清熱解毒功效，主治流行感冒、麻疹和風疹，為青藏高原地區常見的一種藥用植物[2]。青藏高原由于海拔較高，形成了寒冷、干燥、太陽總輻射高和近地面紫外線強的獨特生態環境，被稱為“世界第三極”，隨著海拔的增加，影響植物生長發育的生態環境隨之發生顯著的變化[3]。因此，在高原氣候的寒冷、干燥、太陽總輻射高和強紫外輻射等環境因子的綜合作用下，高山植物的形態結構和生長發育受到很大的限制，迫使其不斷對極端環境產生的脅迫做出生理生化方面的響應以增強適應性。有許多文獻報道，低溫、強紫外輻射等逆境脅迫均可造成植物體內的代謝紊亂，破壞自由基動態平衡以致細胞、組織受到損傷[4，5]。但有研究表明，植物體內的適應機制可以有效清除活性氧自由基起到減緩或者保護的作用，且抗氧化物的活力和含量與植物抗逆能力強弱有密切聯系[6，7]。盡管關于逆境脅迫對植物的生長發育、形態結構和生理生化等方面的影響的研究有很多，但自然條件下以青藏高原為實驗平臺，研究高山植物的生理生化機制對高原氣候脅迫的研究報道較少。所以，本研究以美麗風毛菊為材料探究不同海拔下高山植物的生理生化變化規律及其特征，旨在揭示高山植物適應青藏高原極端環境脅迫的抗逆機理，為篩選優良的抗逆種質資源及保護脆弱的高寒生態系統均具有重要而深遠的意義。

2 材料與方法

2.1 采樣地點及氣候概況

美麗風毛菊分別采自青藏高原的2個不同海拔地區，其中西寧位于青藏高原東部邊緣（N36°37′，E101°46′），海拔2200m，年均溫為5.8℃，最冷月均溫為－8.1℃，7月份月均溫為20.0℃，年總輻射為612.5MJ·m－2，7月份降水量79.8mm，屬高原大陸性半干旱氣候；中國科學院海北高寒草甸生態系統定位站（海北）位于青藏高原的東北部，即祁連山東段的冷龍嶺南麓（N37°37′，E101°19′），山地平均海拔4000m，受到明顯的高原大陸性氣候影響，無四季之分，僅有冷暖季之別，年平均氣溫－1.7℃，年平均降水量為590.1mm，降水主要集中在5～9月（占全年降水總量的80%）。年均實際日照時間為2462.7h，占理論可照時間的55.0%，年平均太陽輻射6170MJ·m－2，占太陽總輻射的60.1%。

2.2 光合色素含量的測定

選取健康無傷斑的葉片，避開主脈用打孔器（直徑0.7cm）取18個葉圓片，混合均勻隨機分成3組每組6片，將葉圓片分別放入裝有10mL葉綠素提取液（V丙酮：V乙醇：V水＝45∶45∶10）的試瓶中，密封瓶蓋，密封低溫保存至葉圓片無色約10d。用紫外分光光度計（UV－1601，日本）檢測在663nm、645nm、440nm波長處的吸光值。葉綠素含量的測定與計算參照Arnon的方法[8]，類胡蘿卜素含量的測定與計算參照朱廣廉的測定方法[9]，光合色素以單位葉片重量的含量表示。

2.3 紫外吸收物質的測定

選葉片方法與光合色素含量測定的一樣，取葉圓片混勻后隨機分成3組每組6片置于10mL紫外吸收物質提取液（V甲醇：V鹽酸：V水＝79∶1∶20）的試瓶中，蓋緊密封、避光低溫保存10d至葉圓片無色。用UV－1601紫外分光光度計測量200～400nm吸收值，葉片的紫外吸收物質含量計算參照Caldwell[10]，以 A／cm2表示。

2.4 抗氧化酶活性的測定

稱取0.5g無病蟲害的剪碎的葉組織加入5mL，62.5mmol／L pH 值7.8PBS（含0.3%PVP）和少量石英砂，在冰浴中勻漿，然后15000g，4℃低溫離心10min，取上清液4℃低溫保存。超氧化物歧化酶（SOD）按Giannopolitis C N等的方法測定[11]，以抑制氮藍四唑（NBT）光化還原，50%作為1個酶單位，酶活性以U／g；過氧化物酶（POD）按 Omran R G 等的方法測定[12]，以（A470）每分鐘OD值降低0.01為1個酶單位，酶活性以U／g表示；過氧化氫酶（CAT）按Chacne B等的方法測定[13]，以每分鐘OD值降低（A240的降低）來相對定量過氧化氫酶的酶活性，0.01為1個酶單位，酶活性以U／g表示。

2.5 丙二醛含量的測定

按照Raeri的方法進行測定[14]，用UV－1601紫外分光光度計測量上清液450nm，532nm和600nm吸收值，具體計算如下：

MDA濃度（μmol／L）＝6.45×（OD532－OD600）－0.56×OD450

式中VT 為酶提取液體積（mL）；W 為樣品鮮重（g）。

2.6 數據分析

實驗數據用SPSS16.0統計分析軟件進行統計分析并選用LSD進行顯著性檢驗。數據為5次以上重復的平均值，不同小寫字母表示顯著差異性（p＜0.05）。

3 結果與分析

3.1 不同海拔美麗風毛菊葉片光合色素含量的變化

在植物光合作用過程中，葉片的光合色素涉及光能的吸收、能量傳遞和轉化，是客觀反映其利用光能的重要指標，也是作為判斷植物光合生理能力、反映環境脅迫狀況的重要指標[15，16]。本實驗發現生長于不同海拔的美麗風毛菊葉片中的光合色素含量有著明顯差別（表1）。隨著海拔的升高，Chla和Chlb均呈現出下降的趨勢，而Car、Chla／Chlb和Car／Chla＋b的比值則呈現出增加的趨勢，這可能與海北地區海拔較高且氣候寒冷多變有關。葉綠素含量的下降，可能有利于減少葉片對光的吸收，使植物免受強輻射的損傷；類胡蘿卜素的增加可以對強近地面UV－B輻射和高太陽輻射的脅迫起到促進過剩光能耗散的作用，避免強光對光合機構破壞。

表1 不同海拔美麗風毛菊葉片光合色素含量的變化

3.2 不同海拔美麗風毛菊抗氧化酶活性的比較

植物在受到逆境脅迫時，其生理生化代謝發生紊亂以致產生多種自由基，而體內抗氧化酶系統中的超氧化物歧化酶（SOD）可將超氧陰離子O－2歧化為 H2O2和O2；過氧化物酶（POD）能將H2O2和有機的氫過氧化物等底物轉變成無毒性物質；過氧化氫酶（CAT）再把H2O2催化生成H2O從而減少體內自由基[17]。本研究結果發現，隨著海拔的升高美麗風毛菊的抗氧化酶SOD、POD和CAT的活性也出現增強的趨勢，其中生長在海北地區的美麗風毛菊體內超氧化酶歧化酶（SOD）活性比生長在西寧地區的高且具有顯著性差異（表2）。

表2 不同海拔美麗風毛菊抗氧化酶活性的比較

3.3 不同海拔美麗風毛菊葉片紫外吸收物質和丙二醛含量的比較

植物體內的丙二醛（MDA）是細胞中活性氧代謝失衡，導致產生過量的自由基作用于生物膜的多不飽和脂肪酸發生過氧化反應的產物，其含量的多少可以反映逆境對其膜受到損傷程度的大小[18]。本研究結果表明，美麗風毛菊葉中膜脂過氧化產物的含量隨海拔升高呈增加趨勢，其中生長在海北地區的葉片MDA含量較高，但兩地差異不顯著。還有植物體內的次生代謝產物（黃酮類和酚醛類等化合物）對青藏高原地區強近地面UV－B輻射和高太陽輻射具有明顯的吸收作用，這種生理生化特性是植物響應環境和自我保護的機制。在研究中，也發現不同海拔的美麗風毛菊葉片的紫外吸收物質含量存在差異并且隨著海拔的升高而增加，但無顯著性（表3）。

表3 不同海拔美麗風毛菊葉片丙二醛和紫外吸收物質含量的比較

4 討論

青藏高原海拔較高，空氣稀薄以及上空臭氧總量低于同緯度的地區，導致到達近地面的UV－B輻射增加，形成了獨特的生態環境，是研究植物對極端環境的響應和適應性的理想實驗平臺[19]。在極端環境的各種脅迫因子相互“耦聯”作用下，植物不僅通過改變葉片形態、調整葉片角度、增加葉表蠟質層和微絨毛反射部分太陽輻射而有效避免強光和紫外線造成的損傷，還從生理生化過程中作出一系列的調整以適應寒冷和干旱的脅迫，尤其是植物體內的一些次生代謝產物和抗氧化酶系統，能清除活性氧自由基，維持細胞中活性氧代謝的平衡[20～22]。但在青藏高原地區低溫和強輻射等環境因子脅迫均能引起植物生理代謝的失衡，活性氧自由基含量積累，導致膜系統、蛋白質和核酸等大分子的破壞，以致植物的生長發育和生殖繁衍產生深遠的負面影響[23～25]。然而，高山植物雖然生長于惡劣的環境條件下，但其光合作用等生命過程并未明顯減弱，而呈現出很強的適應性，這可能與其體內的抗氧化系統的保護有很大關系[26，27]。

美麗風毛菊在青藏高原一定海拔范圍內出現垂直分布，是一種多年生的高山植物。本研究結果不僅發現，隨著海拔的升高，美麗風毛菊葉片中的膜脂過氧化而產生的MDA含量升高，楊景宏等研究紫外線－B輻射對作物小麥葉綠體膜組分和膜流動性的影響，發現UV－B輻射誘導小麥葉片中MDA含量升高是膜脂發生過氧化導致葉綠體膜系統受破壞造成的；羅麗瓊等[28]以云南報春花為材料研究了在不同海拔地區UV－B輻射對其葉片中丙二醛、蛋白質含量的影響也得出了相似的結果，這說明隨著高海拔升高近地面UV－B輻射增強植物受到脅迫致使質膜發生過氧化損傷更為嚴重。我們的研究還發現，隨著海拔的升高美麗風毛菊葉片中的葉綠素含量出現降低的趨勢而構成比例卻相反，葉綠素含量的降低可能是減少光能的吸收防止因光能過剩而發生光破壞現象，Car含量增加和Car／Chl比值升高可以促進非光化學猝滅耗散過剩光能起到光破壞防御的功能，這些變化可能是植物光合生理對青藏高原地區高太陽輻射、強紫外線等獨特環境的響應和自我保護的機制。

張紅霞等以蠶豆為研料研究不同強度UV－B輻射對蠶豆幼苗生長發育的影響，結果表明UV－B輻射降低葉綠素a、b及總葉綠素含量[29]。且我們的研究還發現美麗風毛菊的SOD、POD和CAT活性也隨著海拔的升高而增加，其中兩個不同海拔地區相比，海北地區的美麗風毛菊的SOD活性較高且具有顯著差異。通常認為SOD是細胞抗氧化脅迫的關鍵酶，其活性的升高有利于低溫、強UV－B輻射等逆境因子脅迫產生的O2等活性氧自由基的清除，與此同時的葉片中POD和CAT活性也升高，有利于細胞中進一步對H2O2的清除。李惠梅等以不同海拔的麻花艽為材料研究結果也發現類似的現象[29]。此外，美麗風毛菊葉片中的紫外吸收物質含量也隨著海拔的升高而呈現增加的趨勢。有許多研究結果證明，植物葉片表皮細胞含有一些類黃酮和酚醛類化合物能大量吸收UV－B輻射改變穿透率起到保護作用[30]。有諸多學者認為植物受到UVB輻射后體內類黃酮明顯增加，且這些類黃酮化合物在紫外線的波長范圍內具有吸收作用，從而可減少UVB輻射對核酸、蛋白質等大分子的破壞作用，形成保護自我保護機制，如葉蠟中的黃酮類化合物為游離狀態，表現為O－甲基化和親脂性等特性，這使化合物紫外吸收特性偏向更短的波長范圍，以至于在230～320nm處具有明顯的特異吸收短波長紫外線的能力，從而保護植物葉片免遭紫外線傷害[31]；還有類黃酮可以直接清除自由基（羥自由基、氧自由基），如植物體內4－羥基黃酮等轉變成保護性黃酮清除氧化自由基。

5 結語

隨著海拔升高極端環境脅迫壓力增加，美麗風毛菊從生理生化方面做出了適應性響應，首先通過增加葉片表皮細胞中的紫外吸收物質含量濾除UV－B輻射以減少機體損傷，同時抗氧化酶系統之間可能存在一定的協同關系通過增強抗氧化酶活性清除低溫、強近地面UV－B輻射等脅迫產生的自由基以維持機體代謝的平衡，這種協同作用可能是美麗風毛菊適應高山環境脅迫的重要生理機制之一。

[1]劉尚武.青海植物志[R].西寧：青海人民出版社，1999.

[2]劉永昌，劉海青.青海省風毛菊屬藥用植物資源的初步調查[J].中國民族民間醫藥雜志，2001，52（1）：289～289.

[3]潘紅麗.海拔梯度上的植物生長與生理生態特性[J].生態環境學報，2009，18（2）：722～730.

[4]巫光宏.低溫脅迫對馬占相思樹代謝的影響研究[J].林業科學研究，2001，14（6）：633～640.

[5]朱鵬錦.植物對UV－B輻射脅迫響應的研究進展[J].熱帶生物學報，2011，2（1）：89～96.

[6]江福英，李 延，翁伯琦.植物低溫脅迫及其抗性生理[J].福建農業學報，2002，17（3）：190～195.

[7]王海霞.植物對增強UV－B輻射的防御機制研究進展[J].西北植物學報，2007，27（7）：1491～1497.

[8]Arnon D I.Copper enzymes in isolated chloroplasts[J].Polyphenoloxidase in Beta vulgaris.Plant Physiology，1949，24（1）：126～138.

[9]朱廣廉.植物生理實驗[M].北京：北京大學出版社，1990.

[10]Caldwell M M，Solar ultraviolet radiation as an ecological factor for alpine plants[J].Ecological Monographs，1968，38（3）：243～268.

[11]Giannopolitis C N and S K Ries.Superoxide Dismutases：II.Purification and Quantitative Relationship with Water－soluble Protein in Seedlings[J].Plant Physiology，1977，59（2）：315～318.

[12]Omran R G，Peroxide levels and the activities of catalase，peroxidase，and indoleacetic acid oxidase during and after chilling cucumber seedlings[J].Plant physiology，1980，65（2）：407～408.

[13]Chance B and A Maehly，Assay of catalases and peroxidases[J].Methods in enzymology，1955（2）：764～775.

[14]Ranieri Glutathione－ascorbic acid cycle in pumpkin plants grown under polluted air in open－top chambers[J].Journal of plant physiology，1993，142（3）：286～290.

[15]Matsubara S，Lutein epoxide cycle，light harvesting and photoprotection in species of the tropical tree genus Inga.Plant[J].Cell ＆ Environment，2008，31（4）：548～561.

[16]張守仁.葉綠素熒光動力學參數的意義及討論[J].植物學通報，1999，16（4）：444～448.

[17]Yannarelli G G.Heme oxygenase up－regulation in ultraviolet－B irradiated soybean plants involves reactive oxygen species[J].Planta，2006，224（5）：1154～1162.

[18]Treutter D，Significance of flavonoids in plant resistance and enhancement of their biosynthesis[J].Plant Biology，2005，7（6）：581～591.

[19]莫申國.青藏高原的主要環境效應[J].地理科學進展，2004，23（2）：88～96.

[20]戴怡齡.寒區不同海拔橘黃罌粟葉片結構特征的比較研究[J].西北植物學報，2004，24（3）：495～503.

[21]梁 濱，周 青.UV－B輻射對植物類黃酮影響的研究進展[J].中國生態農業學報，2007（3）：191～194.

[22]左園園.短期增強UV－B輻射對青榨槭幼苗生理特性的影響[J].應用生態學報，2005（9）：1682～1686.

[23]陳 拓，安黎哲.UV－B輻射對蠶豆葉膜脂過氧化的影響及其機制[J].生態學報，2001，21（4）：579～583.

[24]馮國寧.增強UVB輻射對菜豆蛋白質代謝的影響[J].植物學報，1999（8）：833～836.

[25]強維亞.增強UV－B輻射對大豆胚軸DNA損傷、修復和蛋白質含量的影響[J].生態學報，2004（4）：852～856.

[26]姚曉芹，劉 慶.陸生植物體內酶系統對UV－B輻射增強的響應[J].應用生態學報，2006（5）：939～942.

[27]董新純.增強UV－B條件下類黃酮與苦蕎逆境傷害和抗氧化酶的關系[J].山東農業大學學報：自然科學版，2006（2）：157～162.

[28]羅麗瓊.低緯高原地區UV－B輻射對報春花丙二醛、蛋白質含量的影響[J].廣西植物，2008（1）：130～135.

[29]張紅霞，吳能表，洪 鴻.不同強度的UV－B輻射對蠶豆種子萌發及幼苗生長的影響[J].西南大學學報：自然科學版，2008（8）：132～136.

[30]李惠梅，師生波.增強UV－B輻射對麻花艽葉片的抗氧化酶的影響[J].西北植物學報，2005（3）：519～524.

[31]李 鵬.抗UV－B輻射植物黃酮類化合物研究進展[J].生態學雜志，2001（6）：36～40.

[32]林植芳.亞熱帶植物葉片UV－B吸收化合物的積累[J].生態學報，1998（1）：90～95.