津力達口服液對2 型糖尿病模型大鼠血液和腎臟氧化應激標志物的影響

國 蓉，鄒俊杰，何逸飛，劉志民

2 型糖尿病已成為21 世紀人類的一個主要健康威脅，到2030年，糖尿病患者的總人數將上升到5.52 億［1］。在糖尿病的發生和發展過程中，大血管病變是2 型糖尿病患者早亡及致殘的主要原因［2］，而氧化應激在其中起著關鍵作用［3］。氧化應激定義為反應性的活性氧簇的增加和(或)固有的抗氧化支持物質的受損，這一過程常見于長期血糖和脂調節紊亂［4］。但是，盡管氧化應激在糖尿病的發生發展中起到非常關鍵的作用，但大多數臨床試驗并未顯示出抗氧化劑和維生素有任何長期的療效［2］。因此，越來越多的報道關注口服降血糖藥物減少氧化應激的作用。津力達口服液是由人參、黃精、蒼術等多味中藥組成的制劑，具有降糖、減輕多種糖尿病臨床癥狀的作用。本研究以高脂飼養的大鼠為模型，觀察津力達口服液在治療糖尿病腎病方面的作用，為臨床防治糖尿病腎病提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性SD 大鼠100 只，體質量180～200 g，由第二軍醫大學實驗動物中心提供［生產許可證號:SCXK(滬)2007-0003;使用許可證號:SYXK(滬)2007-0003］。無特定病原體(SPF)環境飼養，溫度20～25℃，濕度56%，自由飲水，12/12 h 晝夜規律，喂食時間為每日下午5:00 至次日上午8:00。

1.2 試藥與試劑 津力達口服液(石家莊以嶺藥業股份有限公司，批號:971218，規格10 ml/支;主要成分:人參、黃精、麥門冬、葛根、蒼術、佩蘭、苦參、丹參);鏈脲佐菌素(STZ)(Sigma)，疾病模型動物脂類誘導飼料購自江蘇美迪森生物公司，谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)、脂質過氧化物的產物丙二醛(MDA)測定試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。鼠血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、一氧化氮(NO)及一氧化氮合酶(NOS)試劑盒均購自EMD biosciences 公司。

1.3 儀器 自動生化分析儀(日立)，酶聯檢測紫外分光光度計(島津UV2401PC)，TL-820 系列冷凍切片機(泰維)，BX53 顯微鏡(奧林巴斯)。

1.4 方法

1.4.1 2 型糖尿病模型建立:大鼠適應性飼養2 d后隨機分組，建立模型的大鼠予脂類誘導飼料喂養4 周后予鏈脲佐菌素(STZ)溶于檸檬酸緩沖液(pH 4.3，0.1 mol/L)30 mg/kg 一次性腹腔注射;正常對照組給予普通飼料喂養4 周后予同劑量的檸檬酸緩沖液(pH 4.3，0.1 mol/L)腹腔注射。繼續普通飼料喂養2 周后禁食8 h，按2 g/kg 灌服20%D-葡萄糖溶液，做口服糖耐量試驗，0 min 和120 min 血糖分別＞7.0 mmol/L 和11.0 mmol/L 為造模成功。本實驗中最終得到75 只成功造模大鼠，取40 只進行下一步實驗。

1.4.2 大鼠分組:造模成功的40 只2 型糖尿病大鼠隨機分為糖尿病模型組和津力達治療組，每組20只。另取20 只正常大鼠作為正常對照組。津力達治療組給予津力達口服液5 ml/kg 灌胃、2/d，正常對照組及糖尿病模型組給予同劑量0.5%羥甲纖維素鈉溶液灌胃，持續8 周后處死。

1.5 生化指標檢測 實驗8 周時測大鼠體質量，在最后一次灌胃后將大鼠禁食12 h，后用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉，開胸取主動脈血，血清在－70℃保存備用。同時檢測血糖、甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)(日立自動化生化分析儀)，迅速取出腎臟，分離皮質，－70℃液氮保存備用，實驗終止后動物斷頭處死。

1.6 腎組織高級糖化終產物(advanced glycation end，AGE)、GSH-Px、SOD、丙二醛(MDA)測定AGE 采用Monnier 等［5］方法:將腎皮質剪碎，勻漿、離心，沉淀中加氯仿∶ 甲醇(2∶ 1)10 ml 去脂，4℃搖振過夜，經水化沖洗，在HEPES 緩沖液過夜，加入280U 型膠原酶，37℃震蕩消化24 h。離心取上清液，用分光光度計在370/440 nm 處測定熒光強度，其值用空白膠原酶校正。消化液中羥脯氨酸(Hyp)含量用氨胺T 法測定，AGE 含量以每mg Hyp 所含熒光強度為一個任意單位，用AU/mg Hyp 表示。其余指標檢測方法:上清液按照ELISA 試劑盒的操作說明對樣品進行檢測，在酶聯免疫檢測儀上測490 nm波長的樣品吸收值，通過標準品的濃度吸收值，繪制標準曲線，再根據樣品的吸收值在該曲線上查出相應指標水平。

1.7 血液SOD、GSH-Px、MDA、NO、NOS 及AGE-P測定 給藥第4、8 周末分別采取鼠尾血樣本，血清離心去除細胞碎片，按照ELISA 試劑盒的操作說明對樣品進行檢測，在酶聯免疫檢測儀上測490 nm 波長的樣品吸收值，通過標準品的濃度吸收值，繪制標準曲線，再根據樣品的吸收值在該曲線上查出相應指標水平。

1.8 腎小球截面積計算 腎組織經甲醛固定后進行HE 染色。應用CMIAS 多功能真彩色病理圖像分析系統，每張HE 染色切片隨機測定50 個腎小球截面積。

1.9 統計學處理 應用SPSS 18.0 軟件進行統計學分析，采用方差分析，α=0.05 為檢驗水準。

2 結果

2.1 體質量及血生化指標變化 入選時各組體質量、血糖、TG 和TC 水平均無明顯差異;飼養8 周期間根據殘余食物量計算，糖尿病模型組和津力達治療組的攝食量也無明顯差異。糖尿病模型組和津力達治療組體質量在給藥第8 周均明顯低于正常對照組(P＜0.05);津力達治療組空腹血糖、TC、TG 均顯著低于糖尿病模型組(P＜0.05)，除空腹血糖(P＜0.05)外，其余指標與正常對照組比較差異無統計學意義(P ＞0.05)。見表1。

表1 給藥第8 周時3 組大鼠體質量及血生化指標比較(±s)

表1 給藥第8 周時3 組大鼠體質量及血生化指標比較(±s)

注:與正常對照組比較，aP＜0.05;與糖尿病模型組比較，cP＜0.05

2.2 腎小球截面積及腎臟抗氧化酶活性、MDA 及AGE 含量變化 相比正常對照組，給藥8 周時糖尿病模型組腎臟SOD、GSH-Px 活性下降，MDA 及AGE含量升高(P＜0.05);津力達治療組相比糖尿模型病組腎臟SOD、GSH-Px 活性升高(P＜0.05)，MDA和AGE 含量降低(P＜0.05);糖尿病模型組腎小球截面積及腎臟AGE 含量顯著大于、高于正常對照組(P＜0.05)，津力達治療組與糖尿病模型組比較腎小球截面積顯著減小(P＜0.05)。見表2。

表2 給藥第8 周時3 組大鼠腎小球截面積及腎臟SOD、MDA、GSH-Px、AGE 含量的變化(±s)

表2 給藥第8 周時3 組大鼠腎小球截面積及腎臟SOD、MDA、GSH-Px、AGE 含量的變化(±s)

注:SOD:超氧化物歧化酶，GSH-Px:谷胱甘肽抗過氧化物酶，MDA:丙二醛，AGE:高級糖化終產物;與正常對照組比較，aP＜0.05;與糖尿病模型組比較，cP＜0.05

2.3 血液氧化應激標志物的變化 與正常對照組比較，給藥第4 周末糖尿病模型組血SOD、GSH-PX、NO、NOS 活性顯著降低(P＜0.05)，而MDA 和AGE含量顯著增高(P＜0.05)。給藥第8 周末糖尿病模型組與正常對照組相比上述指標趨勢相同，GSH-Px有所回升(P＜0.05)。而給藥第4、8 周末津力達治療組上述指標均有所改善(P＜0.05)。給藥第8 周末，津力達治療組GSH-Px 比本組給藥第4 周末顯著升高(P＜0.05)。見表3。

表3 給藥4、8 周時3 組大鼠血液SOD、MDA、NO、NOS 及AGE 的變化(±s)

表3 給藥4、8 周時3 組大鼠血液SOD、MDA、NO、NOS 及AGE 的變化(±s)

注:SOD:超氧化物歧化酶，GSH-Px:谷胱甘肽抗過氧化物酶，MDA:丙二醛，NO:一氧化氮，NOS:一氧化氮合酶，AGE:高級糖化終產物;與正常對照組比較，aP＜0.05;與糖尿病模型組比較，cP＜0.05;與本組給藥第4 周末比較，eP＜0.05

3 討論

自由基和活性氧族以及伴隨發生的氧化應激反應在肥胖、高血糖發生、發展中及各種急性、慢性炎癥反應中發揮非常重要的作用［6］。氧化應激過程中，內皮細胞線粒體生成的超氧陰離子自由基增多是各種糖尿病并發癥機制中的共同關鍵因素［7-9］。多元醇通路激活、AGE 形成、蛋白激酶C 途徑和氨基己糖途徑的激活，都會引起細胞功能的嚴重紊亂，導致各種并發癥的發生［10-13］。而AGE 是蛋白質的氨基、脂質和脂蛋白等通過非酶糖基化反應后產生的終末產物。AGE 修飾后的蛋白質將會被免疫細胞降解清除，而AGE 與細胞表面受體的相互作用是氧化應激發生的必要因素［14-15］，此外，AGE 修飾后的蛋白質還會導致腎小球細胞外基質(ECM)增加，IV 型膠原等基質蛋白交聯，開啟相關基因，最終引起腎小球肥大，基底膜增厚，導致糖尿病腎病的發生和發展［16-20］。

祖國醫學認為，津液代謝失常、水谷轉輸利用失衡是消渴病的機理。脾失健運，不能散精上輸于肺;肺津無以輸布，則口渴多飲，脾不能為胃行其津液。燥熱內盛，消殺水谷，則消谷善饑，脾不能轉輸水谷精微;水谷精微下流膀胱，則小便量多而昧甘;水谷精微不能濡養肌肉，故形體漸瘦。而脾失轉輸的因素，與脾氣虛乏、脾陰不足、濕邪困脾、脾經伏熱、氣血郁滯等有關。治療應以健脾運津、益氣養陰為主。津力達口服液以益氣養陰、健脾運津為主，以清熱、化濕、活血為輔。主要成分人參治脾氣不足，黃精滋養固攝脾陰，麥門冬、苦參養陰生精，葛根清熱，蒼術、佩蘭化濕，丹參活血。近年來的臨床觀察也證實了津力達口服液具有十分重要的臨床價值［21-24］。

本研究發現，高脂飼養大鼠可致其體質量明顯增加，血糖、血清、TG、TC 水平明顯升高，津力達治療組上述指標明顯改善。另外，腎臟是比較明顯的受累器官，SOD 活性，MDA 濃度及AGE 等均是反映機體氧化應激水平的可靠指標，間接反映腎臟損傷的程度。本研究結果顯示，糖尿病模型組血清及腎臟內SOD 較正常對照組顯著降低，血清GSH-Px 較正常對照組升高，說明糖尿病模型組腎臟內氧化應激水平升高，抗氧化能力下降。機體內GSH-Px 和NO 水平濃度也間接反映大鼠器官功能的損傷程度。本研究結果顯示，糖尿病模型組血清GSH-Px較正常對照組顯著降低，NO 顯著升高。用津力達口服液干預8 周后，津力達治療組較糖尿病模型組腎臟及血液各項指標均有一定程度的改善，因此認為津力達口服液可以有效抑制2 型糖尿病模型大鼠體內的氧化應激反應。

綜上所述，津力達口服液可改善2 型糖尿病模型大鼠體內氧化應激標志物的表達，可能對糖尿病并發癥有一定的防治作用，但其防治糖尿病并發癥的療效、作用機制有待于更深入的體內外實驗進行驗證。

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