過氧化物酶在多孔磁性微球修飾電極上的直接電化學行為研究

譚向恩，賴國松，韓德艷，張海麗

(湖北師范學院 化學與環境工程學院，湖北 黃石 435002)

過氧化物酶是由微生物或植物所產生的一類氧化還原酶，它們能催化很多反應，并參與諸多不同類型的生理過程，如生物活化氧分子和生物合成細胞壁等。所以研究這一類型酶的直接電化學行為，不僅可以模擬生物體內氧化還原系統，而且對理解，認識，揭示其中的電子轉移機制具有重要意義[1～2]。但是由于酶分子比較大，結構復雜，氧化還原中心被包裹在蛋白質的多肽鏈中，很難接近電極表面，同時蛋白質很容易在固體電極表面失活[3]。因此，人們研究各種酶的固定化材料比如納米材料[4]，表面活性劑[5]等，為酶提供適宜的微環境。

近年來，由于一些多孔材料具有均勻的孔徑，大的比表面積，良好的生物兼容性和化學穩定性而被廣泛的用于酶和蛋白質的固定[6～7]。作為一種重要的納米材料，磁性納米粒子因其優良的性質近年來越來越得到廣泛關注，并先后在包括酶固定在內的許多領域得到成功應用[8]。殼聚糖具有許多優良的性質生物兼容性、低毒性、化學惰性和優異的成膜能力，常在傳感器的制備中用作成膜材料[9]。本文按文獻[10]合成了一種多孔的殼聚糖磁性微球(PMMS)，并研究了過氧化物酶(POD)在修飾了多孔殼聚糖磁性微球的碳糊電極(CPE)上的直接電化學行為。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

殼聚糖(脫乙酰度≥90%)(深圳伯奧生命科技公司)；過氧化物酶(POD)(美國Sigma公司)；過氧化氫(H2O2，30%)，購于武漢華飛化學試劑公司，其準確濃度通過高錳酸鉀滴定法得到；25% 戊二醛；0.1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖溶液 (PBS) 通過Na2HPO4和NaH2PO4配制而成并用0.1 mol·L-1的NaOH或H3PO4溶液調節合適的pH值。0.10 mol·L-1KCl的5.0m mol·L-1K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1∶1) 溶液；其它試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水。CHI830B 型電化學工作站(上海辰華儀器公司)；三電極系統：飽和甘汞電極為參比電極，鉑電極為輔助電極，修飾電極為工作電極。

1.2 修飾電極的制備

將1.8∶1(m∶m)光譜純石墨粉和石蠟油在瑪瑙研缽中充分混勻，然后將此碳糊均勻地填入內徑為2 mm的玻璃管中并與其中的銅棒壓緊，拋光紙磨平后制得CPE.稱10.0 mg多孔磁性高分子微球(PMMS)于2 mL含5%戊二醛溶液中，超聲分散一段時間后得到5.0 mg·mL-1的均勻分散液。移取5μL該分散液滴加到預處理好的碳糊電極表面，晾干后滴加8μL的POD溶液(8.0 mg·mL-1，溶于0.1 mol·L-1的pH 7.5 PBS中)。該電極在室溫下置于空氣中4h晾干即得到所需的修飾電極POD/PMMS/CPE.

2 結果與討論

2.1 修飾電極的電化學表征

電化學阻抗(EIS)能夠提供電極表面修飾過程中的阻抗變化等有用信息[11]。圖1為PMMS修飾電極(a)， POD/PMMS修飾電極(b)，裸電極(c)在含有0.1 mol·L-1KCl的5.0m mol·L-1K3Fe(CN)6/ K4Fe(CN)6(1∶1)溶液中記錄的交流阻抗的Nyquist圖。從圖中可以看出，PMMS修飾電極的RCT較裸電極有明顯減小，說明覆蓋在電極表面的微球能夠在一定程度上促進[Fe(CN)63-/4-]探針與電極表間的電子傳遞；而與PMMS修飾電極相比，POD/PMMS修飾電極的阻抗明顯增加，說明POD已經成功固定在電極表面。

2.2 過氧化物酶在修飾電極上的電化學行為

圖1 PMMS修飾電極(a)，POD/PMMS修飾電極(b)，裸電極(c)的交流阻抗圖譜

利用循環伏安法研究了POD/PMMS修飾電極的電化學行為。與裸電極(圖2a) 相比，POD修飾電極(圖2b)峰電流增大，說明POD有一定的電催化還原作用；PMMS修飾電極(圖2c)與裸電極(圖2a)相比，電流增加，說明PMMS覆蓋在裸電極表面，使電極表面積增大。POD/PMMS修飾電極(圖2d)與PMMS修飾電極(圖2c)相比，還原峰電流明顯增大。說明修飾在電極上的多孔磁性高分子微球能夠較好的吸附POD.此外，當1.0m mol·L-1H2O2加入到該試驗底液中時，POD/PMMS修飾電極的還原峰電流明顯增加(圖2e)，說明該修飾電極對H2O2具有良好的電催化還原作用。

2.3 pH值影響

利用循環伏安法考察PMMS/POD修飾碳糊電極上的伏安行為的影響因素。從pH 5.0到7.5安培電流隨著pH值的增大而增大，pH值超過7.5后電流反而減小。實驗還表明，隨著溶液的pH值增大，H2O2的還原峰電位發生負移，表明此還原過程有質子參與反應，根據實驗中峰電位與pH值的線性關系:Epc(V)= 0.1917-0.066pH知，此反應為一電子一質子過程[12]。此氧化還原反應的機理可能為：

PMMS-POD-Fe(III) + e + H+→ PMMS-POD-Fe(II)H

PMMS-POD-Fe(II)H + 1/2 H2O2→ PMMS-POD-Fe(III)+ H2O

2.4 掃速影響

圖3為在掃速為20～200 mV·s-1范圍內，H2O2在PMMS/POD修飾電極上的峰電流與掃速的平方根成較好線性關系。線性回歸方程為：ipc(10-5A) = 0.1323 + 0.5986v1/2(n=9)，相關系數R=0.9996.故H2O2在該修飾電極上的電催化還原反應為擴散控制過程。由公式Randles - Sevcik equation：ip=2.69 ×105n3/2D1/2v1/2Ac 計算出擴散系數D為5.03×10-10cm2·s-1.

2.5 安培響應

圖3 不同掃速下POD/PMMS修飾電極在1.0 m mol·L-1H2O2底液中的循環伏安圖，內插圖為峰電流與掃速的平方根間的線性關系。(掃速 v=20， 40， 60， 80， 120， 140，160， 180，200 mV s-1)

圖4為在-0.45V工作電位下，向緩沖溶液中(攪拌狀態下)連續滴加H2O2溶液，POD/PMMS修飾電極對H2O2的穩態安培響應圖。內插圖為安培電流和H2O2濃度二者間的工作曲線。在0.1～0.8

3 結論

將POD酶在戊二醛交聯劑作用下固定于多孔磁性高分子微球修飾的碳糊電極的表面，由于多孔狀的結構，不但增大了電極的表面積，吸附更多的POD酶，同時孔洞結構使酶的氧化還原中心與電極表面更加接近，殼聚糖良好的生物兼容性很好的保持了酶的活性，為酶的提供了優良的微環境，實現了酶在電極上的直接電化學，該修飾電極對H2O2有響應，具有較好的選擇性、穩定性和重現性。

[1]Victor G， Ovadia L. Sol -gel vanadium pentaoxide glucose biosensor [J] . J Am Chem Soc， 1993， 115 (6) : 2533 ～ 2534.

[2]左國防. 辣根過氧化物酶直接電化學研究進展 [J] . 天水師范學院學報(自然科學版)， 2007， 27 (5) : 21 ～ 25.

[3]Rusling J F. Enzyme bioelect rochemistry in cast biomembrane like films [J] . Acc Chem Res， 1998， 31 (6) : 363 ～ 369.

[4]Yang Y， Yang M， Wang H， et al. An amperometric horseradish peroxidase inhibition biosensor based on a cysteamine self-assembled monolayer for the determination of sulfides [J]. Sens Actuators B， 2004， 102 (1) : 162 ～ 168.

[5] 徐紅艷， 吳華強， 徐冬梅， 等. 碳納米管負載納米Ni修飾電極及堿液中電氧化甲醇[J]. 應用化學， 2007， 24 (5) : 503 ～ 506.

[6] Jia N Q ， Wen Y L ，Yang G F， et al. Direct electrochemistry and enzymatic activity of hemoglobin immobilized in ordered mesoporous titanium oxide matrix [J]. Electrochemistry Communications，2008， 9 (7) : 774 ～ 777.

[7]LI Y H， Zeng X D， Liu X Y， et al.Direct electrochemistry and electrocatalytic properties of hemoglobin immobilized on a carbon ionic liquid electrode modified with mesoporous molecular sieve MCM-41 [J]. Colloidsand Surfaces B Biointerfaces， 2010， 10 (5): 241 ～ 245

[8]Lai G S， Zhang H L，Han D Y. A novel hydrogenper oxide biosensor based on hemoglobin immobilized on magnetic chitosan microspheres modified electrode [J]. Sensorsand Actuators B， 2008， 129 (1) : 497 ～ 503.

[9]Shi A W，Qu F L，Yang M H，et al. Amperometric H2O2biosensor based on poly-thionine nanowire/HRP/nano-Au-modified glassy carbonelectrode [J]. Sens Actuators B， 2008， 129 (1): 779 ～ 783.

[10]Chen Chen， Yin T T，Chen J ， et al. Adsorptive removal of copper ions from aqueous solution using porous magnetic chitosan microspheres [C]. Remote Sensing， Environment and Transportation Engineering (RSETE)， 2011 International Conference on， 24-26 June 2011， 7350 ～7353.

[11]Feng J J， Zhao G， Xu J J，et al.Direct electrochemistry and electrocatalysis of hemeproteins immobilized on gold nanoparticles stabilized by chitosan [J]. Anal Biochem， 2005， 342 (2) : 280 ～ 286.

[12]Sedigheh H， Hedayatollah G， Ali A M， et al.Direct electrochemistry of chemically modified catalase immobilized on an oxidatively activated glassy carbon electrode [J]. J Appl Electrochem， 2009， 39 (1) :7 ～ 14.

[13]Lai G S， Zhang H L， Han D Y. Amperometric hydrogen peroxide biosensor based on the immobilization of horseradish peroxidase by carbon-coated iron nanoparticles in combination with chitosan and cross-linking of glutaraldehyde [J]. MicrochimActa， 2009， 165 (1) : 159 ～ 165.

[14]Zhang H L， Lai G S， Han D Y. An amperometric hydrogen peroxide biosensor based on immobilization of horseradish peroxidase on an electrode modified with magnetic dextran microspheres [J]. Anal Bioanal Chem， 2008， 390 (3) : 971 ～ 977.