CD44、CD133在肺癌組織中的表達及臨床意義

程呂歡 徐建軍 魏益平 胡欣春

（1江西省胸科醫(yī)院 南昌 330006；2南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 南昌 330006）

CD44、CD133在肺癌組織中的表達及臨床意義

程呂歡1、2徐建軍2魏益平2胡欣春1

（1江西省胸科醫(yī)院 南昌 330006；2南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院 南昌 330006）

目的：探討CD44和CD133在肺癌組織中的表達及其與臨床病理特征之間的關(guān)系。方法：選取南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科2012年6～12月未接受過放療、化療且行肺癌根治術(shù)患者的新鮮肺癌組織標(biāo)本40例，同時收集相應(yīng)癌旁組織(距癌組織5 cm的非癌組織)，采用RT-PCR法檢測40例肺癌組織及其癌旁組織中CD44、CD133的mRNA表達情況。結(jié)果：CD44基因陽性表達率分別為85.0%(34/40)，60.0%(24/40)；CD133基因陽性表達率分別為 72.5%(29/40)，30.0%(12/40)。 CD44、CD133基因在肺癌組織中表達水平高于癌旁組織（χ2=6.270，P=0. 012；χ2=14.459，P=0.000），鱗癌中表達高于腺癌。結(jié)論：CD44、CD133基因高表達可能是促進肺癌發(fā)生發(fā)展的因素之一。

肺癌；CD 44；CD 133；腫瘤干細胞

肺癌發(fā)病率高，惡性程度大，在所有惡性腫瘤中，非小細胞肺癌（non-sma11-ce111ungcarcinoma,NSCLC）的病死率在世界上居第1位[1]，目前，NSCLC的主要治療是以手術(shù)切除、輔以術(shù)后化放療等多學(xué)科的綜合治療，而五年生存率不超過15%。越來越多的研究證明，惡性實體瘤內(nèi)存在著一小部分成瘤能力特別強、分化程度特別低的細胞，被稱之為腫瘤/癌干細胞（tumor/cancer stem ce11s TSC/CSC），該類細胞的特征：自我更新能力、多向分化潛能及強大的動物體內(nèi)成瘤能力，盡管在癌組織中，這類細胞的數(shù)目極少，但是，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中卻發(fā)揮了關(guān)鍵作用，且是腫瘤逃避常規(guī)治療手段，最終導(dǎo)致復(fù)發(fā)的罪魁禍?zhǔn)住?/p>

對于肺癌腫瘤干細胞特征性標(biāo)志物的分選，國際上尚無一致標(biāo)準(zhǔn)，CD44是乳腺癌干細胞的標(biāo)志物，CD133是腦腫瘤等實體瘤干細胞的標(biāo)志物，上述腫瘤中CD133陽性細胞的成瘤性明顯較陰性組強。本研究選擇檢測CD44、CD133在肺癌及癌旁正常組織的表達水平，探討其與肺癌病理組織類型、分化程度等臨床病理特征之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科2012年6～12月行肺癌根治術(shù)患者的新鮮肺癌組織標(biāo)本40例（且未接受過放療、化療），同時收集相應(yīng)癌旁組織（距癌組織5 cm的非癌組織），所有組織標(biāo)本均術(shù)中冰凍確診為惡性，30 min內(nèi)立即取材置于-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆茫恍g(shù)后石蠟切片證實為肺癌，癌旁組織均證實為不含癌的肺組織。分別將40例肺癌組織設(shè)為實驗組，相應(yīng)的癌旁肺組織設(shè)為對照組。40例肺癌患者中，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的21例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的19例；鱗癌32例，腺癌8例；男23例，女 17例；年齡 37～78歲，平均年齡（58.79±10.39）歲，年齡≥60歲19例，＜60歲21例；高分化19例，中分化13例，低分化8例；按2009工ASLC國際肺癌分期標(biāo)準(zhǔn)（第七版）進行TNM分期：浸潤深度T1～T2 25例，T3～T4 15例。

1.2 主要試劑 Trizo1總RNA提取試劑（美國Invitrogen公司），瓊脂糖（西班牙 biowest公司），Ex Taq HS DNA聚合酶（北京鼎國生物工程有限公司），50bp DNA Marker（北京賽諾基因組研究中心有限公司），逆轉(zhuǎn)錄kit（美國Fermentas公司），Tap DNA po1ymerase（日本東洋紡 TOYOBO公司），DNTP（北京賽諾基因組研究中心有限公司），引物合成（北京賽諾基因組研究中心有限公司）。

1.3 主要儀器 SS-325高壓滅菌消毒鍋（日本TOMY），DYY-Ⅲ型穩(wěn)壓電泳儀（上海六一儀器），凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司），多通道PCR擴增儀（美國MJ公司），高速低溫離心機（德國Heraeus公司），-80℃低溫冰箱（德國Thermo Forme公司），紫外分光光度計（美國UVC-515），梯度PCR擴增儀（美國MJ）。

1.4 方法 RT-PCR法將抽提的細胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用Primer5.0軟件和參考有關(guān)文獻，設(shè)計PCR引物（表1）。PCR擴增條件：Taq Mixture(各 2.5 mm)12.5 μL，cDNA 模板 1.0 μL，10 μmo1/L上游引物 1.0 μL，10 μmo1/L，下游引物 1.0 μL，ddH2O 9.5 μL，總體積 25 μL，混勻，6 000 轉(zhuǎn) /min 瞬時離心，PCR擴增儀上擴增，分析 PCR產(chǎn)物，在BIO-RAD凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果并照相，用凝膠成像系統(tǒng)Quantity One軟件分析。判斷基因表達標(biāo)準(zhǔn)：CD44、CD133基因在同一份標(biāo)本中均有目標(biāo)擴增條帶，條帶所在的位置在DNA Marker的對照下與引物設(shè)計的擴增片段長度一致，判斷為該標(biāo)本 CD44、CD133 基因表達；CD44、CD133 mRNA 表達的檢測：以檢測到清晰的條帶作為有表達，記為“+”，沒有表達記為“一”，用相應(yīng)的癌旁正常肺組織作為對照。

表1 CD44、CD133引物序列和擴增產(chǎn)物長度

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS17統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料兩樣本率的比較采用卡方檢驗，P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌及癌旁組織中CD44、CD133基因表達應(yīng)用RT-PCR檢測NSCLC肺癌組織及癌旁組織CD44 基因，獲得基因片段為 195 bp，Lane 1、3、5、7、9 為肺癌組織；Lane 2、4、6、8、10 為癌旁組織，Lane1、3、4、7 為陽性表達，Lane 2、5、6、8、9、10 為陰性表達；應(yīng)用RT-PCR檢測NSCLC肺癌組織及癌旁組織CD133基因，獲得基因片段為111 bp，Lane 1、3、5、7、9 為肺癌組織，Lane 2、4、6、8、10 為癌旁組織，Lane1、3、4、5、7 為陽性表達，Lane 2、6、8、9、10為陰性表達。

2.2 CD44、CD133 mRNA在肺癌組織中表達的陽性率 肺癌及癌旁組織中CD44基因表達率為85.0%(34/40)、60.0%(24/40)；CD133 基因表達率為72.5%(29/40)、30.0%(12/40)；CD44、CD133 基因在肺癌組織中表達水平高于癌旁組織（χ2=6.270，P=0. 012；χ2=14.459，P=0.000），P＜0.05，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

2.3 CD44、CD133基因在肺癌組織中的表達與臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系 CD44、CD133 mRNA在肺癌中的表達水平與患者性別、年齡、吸煙狀況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化程度、浸潤深度無相關(guān)性(P＞0.05)，肺鱗癌中的表達高于腺癌（P＜0.05）。見表3。

3 討論

最初CD133抗原被發(fā)現(xiàn)在人胎肝、骨髓、臍血及外周血CD34造血細胞中選擇性表達，研究證實[2]來源于人結(jié)直腸癌細胞株的HCT116腫瘤細胞球中富含CD133細胞，CD133表面標(biāo)志定位于細胞膜，細胞球更強的轉(zhuǎn)移能力可能通過上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而獲得。魏益平等[3]研究表明，CD133在肺癌標(biāo)本中的陽性表達與患者的淋巴轉(zhuǎn)移和腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，CD133在原始細胞分化為成熟細胞后表達量均下降。Kim等[4]于2005年在NSCLC小鼠模型中，從其最早階段的腫瘤中分離得到一種細胞，將其命名為支氣管肺泡干細胞 (bmchioa1veo1ar stem ce11s，BASCs)。正常情況下，BASCs處于靜止?fàn)顟B(tài)，在體內(nèi)支氣管和肺泡受到損傷時，其則發(fā)生增殖，BASCs自我更新特性明顯，逐漸分化成其它類型的肺上皮細胞，從而表現(xiàn)出了干細胞特性，因此，他們認為遠端肺上皮的干細胞為BAsCs。Janikova等[5]通過對121個非小細胞肺癌（NSCLC）患者肺癌組織樣本檢測干細胞標(biāo)記物CD133和巢蛋白的表達，CD133的陽性表達為19%，巢蛋白在上皮中的陽性表達為66%，共同表達為17%，因此認為CD133是肺癌干細胞的潛在標(biāo)記。Iida等[6]研究顯示CD133在肺癌N417、H358、A549細胞株中表達水平明顯上調(diào)。Hi1be等[7]研究認為，在非小細胞肺癌中，CD133表達明顯增加，而病人的腫瘤血管發(fā)生與腫瘤增長與之密切相關(guān)，CD133可能就是肺干細胞的表面標(biāo)志。Tirino等[8]研究了89例非小細胞肺癌(NSCLC)患者，使用流式細胞儀檢測活體腫瘤細胞，發(fā)現(xiàn)其中72%表達CD133，且CD133陽性肺癌細胞在糖尿病及免疫缺陷小鼠中有更強的成瘤能力。本研究表明在肺癌組織中CD133表達高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與既往研究結(jié)果相符，且與患者性別、年齡、吸煙狀況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化程度、浸潤深度無相關(guān)性(P＞0.05)。

表2 CD44、CD133 mRNA在肺癌及癌旁組織中的表達情況 例

表3 CD44、CD133mRNA在肺癌組織中的表達與臨床病理學(xué)指標(biāo)的關(guān)系 例

CD44屬于粘附分子家族，為一種表面跨膜糖蛋白，多種配體分子能與其結(jié)合，主要參與細胞與細胞外基質(zhì)間、細胞與細胞間的粘附及腫瘤轉(zhuǎn)移過程，CD44又稱白細胞分化抗原分化群第44號(c1uster of differ-entiation 44，CD44)，于 1980 年被首次發(fā)現(xiàn)并確認，CD44參與細胞-細胞、細胞-基質(zhì)之間的相互作用，主要作用在于維持細胞外基質(zhì)的完整性和穩(wěn)定細胞內(nèi)環(huán)境。CD44基因在肺癌中表達情況，既往的研究結(jié)果不盡相同。Takahashi等[9]發(fā)現(xiàn)NSCLC中CD44s的表達顯著低于周圍的正常肺組織，腫瘤細胞逃避人體免疫可能與CD44s的減少有關(guān)。Tran等[10]分別研究了49例鱗癌和49例腺癌后發(fā)現(xiàn)，CD44s、CD44v6在腺癌中的表達水平顯著低于鱗癌。相反，Sa1mi等[11]用免疫組化方法研究肺鱗癌組織進行發(fā)現(xiàn)，CD44v6在正常鱗狀細胞胞漿、胞膜中強表達，而CD44v6在大部分鱗癌組織中表達缺失。CD44在肺癌轉(zhuǎn)移中的作用尚存爭議，Situ等[12]研究71例病人的結(jié)果顯示，CD44v6在鱗癌中的高表達，表達率53.6%，術(shù)后生存率較佳，以1B期鱗癌明顯，經(jīng)多元分析證實，CD44v6是肺癌的一個獨立的預(yù)后指標(biāo)，CD44低表達的肺癌細胞有更長的壽命，Afify等[13]對52例NSCLC患者及15例SCLC患者進行研究，所有鱗癌組織中CD44s和CD44v6均有表達，腺癌中CD44s陽性表達率39%，CD44v6陽性表達率45%，類癌中僅CD44s表達，表達率88%，所有小細胞肺癌中CD44s和CD44v6均陰性表達，腺癌組織中CD44s與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)，CD44v6則與腫瘤大小關(guān)系更為密切。Ko等[14]研究顯示CD44s與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，腫瘤分化程度明顯相關(guān)，可作為腫瘤患者預(yù)后不良指標(biāo)。本研究表明，CD44在肺癌組織中高表達，且鱗癌中的表達高于腺癌（P＜0.05），與患者性別、年齡、吸煙狀況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、腫瘤分化程度、浸潤深度無相關(guān)性(P＞0.05)。

本課題通過對CD44、CD133在肺癌組織中的表達研究，探討其與肺癌生物學(xué)行為之間的關(guān)系，兩項指標(biāo)均在肺癌組織中高表達，與癌旁組織比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），CD44、CD133基因高表達可能是促進肺癌發(fā)生發(fā)展的因素之一；CD44、CD133基因在肺鱗癌中的表達高于腺癌（P＜0.05），可能與其在上皮組織中的高表達有關(guān)。CD133、CD44在肺癌組織中的表達具有一致性，這為進一步研究CD44、CD133雙陽性肺癌細胞的致瘤性提供了一個方向。

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10.3969/j.issn.1671-4040.2013.04.036

2013-03-07）