生產(chǎn)用菌種篩選過程中西林控制的研究

(廣東溢多利生物科技股份有限公司科研中心, 廣東 珠海 519060)

谷氨酸發(fā)酵生產(chǎn)的水平首先取決于生產(chǎn)用菌種的性能。菌種在使用和保藏過程中會(huì)出現(xiàn)衰退現(xiàn)象，要穩(wěn)定并提高發(fā)酵水平，必須定期對菌種進(jìn)行分純篩選，淘汰衰退的菌株，篩選出高產(chǎn)穩(wěn)定的優(yōu)良菌株供生產(chǎn)上使用。我廠是以甘蔗糖蜜為原料，采用在發(fā)酵對數(shù)生長期添加青霉素，然后再添加表面活性劑的發(fā)酵工藝。為了更好的服務(wù)于生產(chǎn)，根據(jù)實(shí)際操作情況，使得菌種篩選也盡量與生產(chǎn)發(fā)酵工藝相統(tǒng)一。

1 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/h2>

1.1 根據(jù)生產(chǎn)用菌種的性能，摸索出一套合適的菌種篩選方法。

1.2 確定搖瓶篩選生產(chǎn)用菌種過程中西林的最佳控制時(shí)間和濃度。

2 實(shí)驗(yàn)原理

在發(fā)酵對數(shù)生長期早期添加青霉素能抑制菌體細(xì)胞壁的合成，形成不完全的細(xì)胞壁，進(jìn)而導(dǎo)致形成不完全的細(xì)胞膜，除去阻礙谷氨酸向外滲透的障礙物，使得谷氨酸得以大量地積累。

作用機(jī)制：添加青霉素是抑制谷氨酸生產(chǎn)菌細(xì)胞壁的后期合成，主要是抑制糖肽轉(zhuǎn)肽酶影響細(xì)胞壁肽聚糖的生物合成。因?yàn)榍嗝顾氐慕Y(jié)構(gòu)和革蘭氏陽性的谷氨酸菌所特有的糖肽的D-Ala-D-Ala 末端結(jié)構(gòu)類似，因而它取代合成糖肽的底物而和酶的活性中心結(jié)合，使五肽末端的丙氨酸不能被轉(zhuǎn)肽酶移去，甘氨酸橋-頭無法與它前面一個(gè)丙氨酸相接，因此交聯(lián)不能形成，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)連接不起來，糖肽合成就不能完成，于是菌體內(nèi)尿二磷和N-乙酰胞壁酸大量堆積，青霉素與轉(zhuǎn)肽酶相結(jié)合，形成了青霉素的酶。結(jié)果形成不完全的細(xì)胞壁，導(dǎo)致形成不完全的細(xì)胞的滲透壓差，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞膜的物理損傷，形成不完全的細(xì)胞膜，失去滲透障礙物，增大了谷氨酸向胞外分泌的滲透能力。

3 實(shí)驗(yàn)器材

3.1 實(shí)驗(yàn)儀器

722可見光電子分光光度計(jì)、雷磁酸度計(jì)、離心機(jī)、SBA-40C生物傳感分析儀旋轉(zhuǎn)式搖床、超凈工作臺(tái)等。

3.2 實(shí)驗(yàn)材料

種子培養(yǎng)基：糖份6%、KH2PO40.2%、尿素1.4%。

發(fā)酵培養(yǎng)基：糖份 15%、H3PO40.1%、消泡油適量。

40%尿素溶液、42%流加糖、1/萬青霉素鉀溶液。

4 實(shí)驗(yàn)方法

4.1 種子培養(yǎng)

在超凈工作臺(tái)上無菌操作，從谷氨酸菌斜面挑取適量菌種接入裝有250ml種子培養(yǎng)基的2L 搖瓶中，雙層紗布封口。置于旋轉(zhuǎn)式搖床上（850r/min），32℃振蕩培養(yǎng)12小時(shí)后進(jìn)行OD 、PH、CV值測定。

4.2 發(fā)酵培養(yǎng)

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取上述種液3ml 接入裝有20ml 發(fā)酵培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，加入40%尿素溶液0.6ml，雙層紗布封口，置于旋轉(zhuǎn)式搖床上（850r/min），32℃振蕩培養(yǎng)至指定時(shí)期加入1/萬濃度青霉素鉀溶液。加完青霉素鉀溶液后，改雙層紗布為單層封口，調(diào)搖床轉(zhuǎn)速為1000 r/min 振蕩培養(yǎng)。發(fā)酵過程中根據(jù)需要流加適量尿素和流加糖。發(fā)酵32小時(shí)后，對發(fā)酵液進(jìn)行OD 、PH、GA值測定。

4.3 分析方法

OD值測定：吸取樣品液，用蒸餾水稀釋50 倍，以蒸餾水作為空白對照，采用722可見光電子分光光度計(jì)于1cm 光程在波長696 nm 處測定。

CV值測定：吸取樣品液10 ml，采用離心機(jī)以3500 r/min 的速度離心10分鐘。

PH值測定：采用雷磁酸度計(jì)直接測定。

GA值測定：吸取樣品液，用蒸餾水稀釋100倍，采用SBA-40C 生物傳感分析儀測定。

5 結(jié)果與分析

本實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)青霉素加入的指定時(shí)期分為6種不同的OD值階段，加入青霉素的濃度分為4種濃度。共做3批搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)，同一時(shí)期同一濃度每批3 瓶。表一為不同時(shí)期不同濃度青霉素添加的搖瓶發(fā)酵實(shí)驗(yàn)GA分析結(jié)果。從表一中可以看出，在OD值為0.38-0.42這個(gè)階段加入1/萬青霉素溶液0.7 ml的效果最好。

總之，在生長的某階段添加青霉素是影響產(chǎn)量的關(guān)鍵因素，加的太早會(huì)抑制菌體生長，不能獲得足夠的菌體量；加的太遲菌體已經(jīng)充分增殖，形成完整的細(xì)胞壁，青霉素不起作用。因此必須在增殖過程的適當(dāng)時(shí)期添加，并且必須在添加后再進(jìn)行一定的增殖。新增殖的細(xì)胞沒有充足的細(xì)胞壁合成，菌體形態(tài)急劇變化，多呈現(xiàn)伸長、膨潤的菌型，完成谷氨酸非積累型細(xì)胞向谷氨酸積累型細(xì)胞的轉(zhuǎn)變。

[1]肖冬光.微生物工程原理.北京：中國輕工業(yè)出版社，2004.

[2]于信令.味精工業(yè)手冊.北京：中國輕工業(yè)出版社，2009.