潰瘍性結腸炎及潰瘍性結腸炎相關性結直腸癌小鼠模型中血管生成因子的表達及其與血管新生的關系

劉維新，張紳，任益，桑立軒，顧壽智

（1.中國醫科大學附屬第一醫院消化內科，沈陽 110001；2.聖隷クリストファー大學，浜松 4338558，日本）

惡性腫瘤是當今導致世界人類死亡的主要原因之一［1］，其中約1/4的患者其病因及發病機制與慢性炎癥相關［2，3］。炎性腸病的年發病率約為2.2/10萬［4］，而炎性腸病患者發生結直腸癌的風險較非炎性腸病者大大增加，患炎性腸病8～10年后結直腸癌的發病率每年以0.5%～1%遞增，30年后高達18%［5］。盡管與炎性腸病相關的結直腸癌僅占全部結直腸癌的1%～2%，但卻是造成炎性腸病患者死亡的主要原因［6］。潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎性腸病中常見的一個類型，反復發作的慢性炎癥常進展為結直腸惡性腫瘤，而惡性腫瘤的發生和進展與其血管生成密切相關。新近研究表明，血管生成素（angiopoietin，Ang）、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）及其受體 Flk-1以及直接或間接調控VEGF表達的缺氧誘導因子（hypoxia inducible factor，HIF）等均是參與調節惡性腫瘤血管生成的重要因素［7］。葡聚糖硫酸鈉（dioctyl sodium sulfosuccinate，DSS）多循環飲用可誘導小鼠發生與人類臨床和病理相似的UC［8］，1，2-二甲肼（DMH）/DSS聯合法可誘導小鼠發生UC相關性結直腸癌 （ulcerative colitis-associated colorectal cancer，UCACRC），可成功模擬炎性腸病誘發結直腸癌的全過程［9］。本文利用以上2種方法建立UC及UCACRC 小鼠模型，檢測 Ang-2、VEGF、Flk-1、HIF在UC組織、UCACRC組織及正常結腸組織中的表達水平，探討其與血管生成的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用雄性5～6周齡Balb/c小鼠66只，體質量在25～32 g之間，由中國醫科大學醫學實驗動物中心提供。適應性喂養1周，恒溫（23±2）℃，恒濕50%±10%，晝夜循環。

1.2 主要試劑

1.2.1 造模試劑：分子量為5 000的DSS，購自Sigma公司；DHM，購自Sigma公司。

1.2.2 免疫組化法試劑：鼠抗鼠VEGF單克隆抗體、兔抗鼠Flk-1多克隆抗體、S-P免疫組化通用型試劑盒和DAB顯色劑，購自北京中山生物試劑公司；鼠抗鼠HIF-1a單克隆抗體，購自武漢博士德生物試劑公司；羊抗鼠Ang-2多克隆抗體，購自泉州市藍圖生物科技有限公司；兔抗鼠CD34單克隆抗體，購自北京博楓科生物技術有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模及分組：配制DMH溶液：將DMH溶于生理鹽水中，配制其終濃度為20 mg/kg，用1 mmol/L NaHCO3溶液調整pH值至6.5～7.0之間。配制DSS飲用水：將分子量為5 000的DSS溶于蒸餾水中，配置成5%的DSS溶液。隨機將小鼠分為3組：應用DSS誘導法建立UC小鼠模型（UC組，n=23），應用DMH/DSS聯合法建立UCACRC小鼠模型（UCACRC組，n=23），同時設立對照組（n=20）。UC 組小鼠以自由飲用5%的DSS飲用水1周+自由飲用蒸餾水1周為1個循環周期；UCACRC組小鼠以腹腔注射法予以20 mg/kg DMH 1次，后自由飲用5%的DSS飲用水1周，繼而自由飲用蒸餾水1周，以上過程為1個循環周期；UC組及UCACRC組均重復9個循環周期。對照組予以蒸餾水自由飲用，不作任何處理。

1.3.2 標本采集：分別于第1個循環周期、第5個循環周期于各組隨機抽取5只小鼠處死，于第9個循環周期處死各組剩余小鼠。將每例的整段結腸取出，測量其長度，后沿縱軸切開，選取紅腫糜爛、潰瘍或腫瘤較明顯處的病變腸段，分為2份。第1份用生理鹽水沖凈后，固定于10%甲醛溶液中，常規石蠟包埋、制作組織切片、常規HE染色后封片，于光鏡下觀察結腸組織病理改變的情況；第2份采用S-P法進行免疫組織化學染色，具體步驟按操作說明書進行，用以檢測3組小鼠結腸組織中Ang-2、HIF、VEGF、Flk-1的表達水平。

1.3.3 造模指標檢測

1.3.3.1 疾病活動指數的評估 每日記錄小鼠的體質量、大便性狀和隱血情況。體質量無下降、大便正常、隱血陰性各記0分；體質量下降＜5%、大便松散、隱血陰性各記1分；體質量下降5%～10%、大便松散、隱血陽性各記2分；體質量下降10%～15%，大便稀便、隱血陽性計3分；體質量下降＞15%、稀便、肉眼血便計4分。將三者的評分相加，記為每只小鼠的疾病活動指數，以評估疾病活動情況。

1.3.3.2 病理組織學損傷評分 在光鏡下觀察結腸組織切片。無潰瘍、無炎癥、無肉芽腫、無纖維化、無病變各記0分；小潰瘍＜3 mm、輕度炎癥、有肉芽腫、病變局限于黏膜下層各記1分；大潰瘍＞3 mm、重度炎癥病變深度達肌層、重度纖維化各記2分。合計總分，算平均值。

1.3.3.3 不典型增生評價標準 按照Morson等［10］描述的標準將不典型增生分為低度和高度不典型增生；癌變分為原位癌（癌細胞浸潤至黏膜層或黏膜下層）和進展期癌（癌細胞浸潤至肌層及以外）。

1.3.4 S-P法結果判定：Ang-2蛋白主要定位于胞質，VEGF和Flk-1蛋白主要定位于胞質和（或）細胞膜，HIF-1a蛋白主要定位于胞質和（或）細胞核，以上四者經S-P法免疫組化染色，DAB液顯色后均以出現棕黃色顆粒為表達陽性。參照Sinicrope的標準［11］進行半定量積分法判斷結果。隨機觀察5個高倍鏡視野，每個視野記數100個腫瘤細胞中陽性細胞的比例，非癌組織則計數著色區100個細胞中陽性細胞的比例。記分如下：（1）按陽性細胞百分比記分：平均陽性細胞的比例<5%，記為0分；5%～25%，記為1分；26%～50%，記為2分；51%～75%，記為3分；>75%，記為4分。（2）按著色強度記分：呈淡黃色者為弱染色，記為1分；呈黃色者為中等染色，記為2分；呈棕黃色者為強染色，記為3分。2個記分的乘積：0分為陰性（-）；1～4分為弱陽性（+）；5～8分為中度陽性（++）；9～12分為強陽性（+++）。

2 結果

2.1 一般情況及疾病活動指數評分

表1 第1、5、9個循環周期末3組小鼠疾病活動指數評分、結腸長度及病理組織學評分Tab.1 Disease activity index，length of colon，and pathohistological index of 3 groups of mice at the end of 1，5，and 9 cycles

UC組及UCACRC組小鼠在第1個循環周期的第3天開始出現精神萎靡、懶動、食量減少、體毛凌亂等癥狀，第4天有1只小鼠出現大便潛血陽性，第5天有3只小鼠出現體質量下降，其中2只小鼠出現大便次數增多、質稀、肉眼血便。至第1個循環周期末2組小鼠中出現大便松散、稀便、隱血陽性、肉眼血便及膿血便者逐漸增多。改為自由飲用蒸餾水后第1～2天仍可見血便，后血便及腹瀉情況逐漸緩解。第5個循環周期開始后第3天即有5只小鼠復現大便隱血陽性，2只復現肉眼血便，且停止飲用DSS飲用水后癥狀持續時間較前1個循環延長。第9個循環開始后第2天2組中即有所有小鼠出現稀便、肉眼血便、體質量下降，改為自由飲用蒸餾水后5 d仍有腹瀉及便血癥狀。對照組小鼠精神及活動正常，食量無明顯改變，體毛柔順，大便性狀及頻次正常。第1、5、9個循環周期末各組小鼠疾病活動指數評分見表1。

2.2 光鏡下結腸病理組織學評估

UCACRC組及UC組：在第1個循環周期末處死的小鼠中結腸組織有明顯的充血水腫，部分黏膜上皮損傷脫落，伴有不同程度的腺體結構消失。第5個循環周期末處死的小鼠中發現多灶性小潰瘍，部分組織的漿膜層出現息肉狀改變，固有腺體萎縮。第9個循環周期末處死的小鼠中，UC組可見黏膜廣泛壞死、糜爛，炎性細胞浸潤全層；UCACRC組出現不同程度的不典型增生和癌變的表現，如細胞出現核大深染、核形不規則、核分裂像增多、核質比例增大等，多見于結腸的遠端；對照組小鼠結腸黏膜上皮完整，腺體排列規則，無充血水腫及糜爛潰瘍。第1、5、9個循環周期末3組小鼠病理組織學損傷評分及結腸長度見表1。第9個循環周期末UCACRC組的不典型增生及癌變率高于對照組及UC組（P＜0.05），UC組不典型增生率高于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 第9個循環周期末3組小鼠結腸腫瘤的發生情況Tab.2 Incidence of colorectal cancer of colon at the end of 9 cycles

2.3 S-P法檢測結果

2.3.1 不同類型的結腸組織中血管生成相關因子的表達：4種血管生成相關因子的陽性表達率在UCACRC組織和UC組織中均在62%以上，在正常結腸組織中均不高于10%，差異均有統計學意義（P＜0.05）；而且UCACRC組織和UC組織相比，除HIF在UCACRC組表達較UC組升高（P＜0.05）外，Ang-2、VEGF、Flk-1的陽性表達率均無統計學差異（P＞0.05）。見表 3。

表3 9個循環周期后血管生成相關因子在不同類型結腸組織中的表達Tab.3 Expression of angiogenesis in the colon tissue of different groups at the end of 9 cycles

2.3.2 UC組不同時期的結腸黏膜中血管生成相關因子的表達：觀察第1、5、9個循環周期末UC組小鼠結腸組織中4種血管生成相關因子Ang-2、HIF、VEGF、Flk-1的表達水平。結果顯示，4種血管生成相關因子的陽性表達率隨實驗周期的增加而增大，第9個循環周期末的陽性表達率與第1個循環周期末相比，均有統計學差異（P＜0.05），與第5個循環周期末相比差異均無統計學意義（P＞0.05）；且第5個循環周期末與第1個循環周期末相比，差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表4。

表4 血管生成相關因子在UC組小鼠不同時期的結腸組織中的表達Tab.4 Expression of angiogenesis in the colon tissue of UC group in different cycles

3 討論

當今UC的發病率日益增高，其相關性結腸癌的發病率也隨之上升，UC相關性癌變逐漸成為當下醫學研究的熱點之一［12］。此種癌變在炎性腸病中具有高致死率和低發生率的特點，所以在臨床收集多個病例難度較大，對其主要的研究手段為建立相應的動物模型，模擬UC發生癌變的過程。本實驗擬應用DSS誘導法建立UC小鼠模型，應用DMH/DSS聯合法建立UCACRC小鼠模型，結果顯示單純使用DSS可有效建立UC模型小鼠，但該組發生低度不典型增生的概率僅為15.38%（2/13），且未發現癌變者。加用DMH者，即采用DMH/DSS聯合法處理的小鼠，多個循環后發生不典型增生和癌變的概率明顯提高，可達92.31%（12/13）。由此我們可以認為DMH/DSS多個循環聯合應用可以建立較理想的UCACRC小鼠。通過以上2種造模方法，我們可以初步建立UC及其相關癌變的動物模型，從而可對人類UC及其相關癌變的發生、發展機制進行研究，研發相應的治療藥物，預防結腸癌的發生、發展。

UC特別是其相應癌變的發生、發展和轉移與血管的新生密切相關。正常情況下，體內血管的生長與抑制處于動態平衡狀態，一旦失衡就會導致許多疾病的發生［13］。炎癥及癌變過程中血管的新生主要依賴于各種血管生成相關因子的調節，Ang-2、HIF、VEGF、Flk-1為常見的4種血管生成相關因子。本實驗在成功建立動物模型后對以上4種血管生成相關因子的表達水平進行了檢測。通過S-P免疫組化方法檢測以上四者在結腸炎癥組織、癌變組織及正常組織中的表達水平，發現Ang-2、HIF、VEGF、Flk-1在UC組織、UCACRC組織中呈高表達，其陽性率明顯高于正常結腸組織（P＜0.05），且通過比較其在UC組第1個周期末、第5個周期末、第9個周期末3個時期的陽性表達率，發現隨著實驗周期增加，四者的表達水平均有所增高。

綜上所述，采用DSS誘導法及DMH/DSS聯合法可建立UC及UCACRC小鼠模型，成功模擬結腸的正常組織—炎癥組織—不典型增生—癌變的發展過程。血管生成相關因子Ang-2、HIF、VEGF、Flk-1在UC及UCACRC的血管生成中起重要作用，與炎癥及腫瘤的發生、發展密切相關。特別是HIF在UCACRC中生成表達較UC組升高，表明炎癥發生時常造成組織缺血及缺氧，在有致癌因素存在時加重組織異常增生，最終導致組織的惡變。目前血管生成相關因子的作用越來越受到重視，針對抗血管生成藥物及相應治療的探討已成為醫學科研的熱點。研究各種血管生成相關因子在UC及其相應癌變中的表達，有助于進一步了解結腸炎—癌改變的發生和發展，同時為抗血管生成治療提供有力依據。

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