快速導流雜交基因芯片法檢測人乳頭瘤病毒的實驗觀察

焦淑靜

流行病學研究證實人乳頭瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)感染是女性宮頸上皮內瘤變(Cervical intraepithelial neoplasia，CIN)和宮頸癌的主要病因，對HPV感染的檢測和分型是處理宮頸病變的重要依據[1]。HPV的不同型別引起細胞病理的類型改變不同，因此，準確的基因分型，及時明確患者感染HPV的基因型別對感染的治療、宮頸病變的預防及流行狀況的調查均有重要的意義[2]。我們采用核酸分子快速導流雜交基因芯片分型技術(HybrMax法)對我院婦科門診796例婦女進行了HPV感染的分型檢測，實驗結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2009年4月至2012年3月在我院婦科門診就診患者796例，采用HybrMax法檢測人乳頭瘤病毒并進行基因分型。隨機選取502例，年齡21～53歲，平均年齡(36±11.5)歲，其中宮頸細胞學檢查正常者116例，細胞學異常者386例。對細胞學檢查異常者在陰道鏡下行宮頸多點活檢進一步作病理學檢查，診斷標準采用2001年國際癌協會TBS診斷系統。包括:宮頸慢性炎癥(炎癥組)173例，宮頸上皮內瘤變Ⅰ級(CINⅠ組)92例，上皮內瘤變Ⅱ級(CINⅡ組)52例，上皮內瘤變Ⅲ級(CINⅢ組)44例，宮頸癌組25例，所有標本采集和診治過程均經就診者本人同意。

1.2 實驗方法 HPV分型檢測的標本取樣步驟和要求按宮頸細胞學取材常規進行，標本放置在專用樣本收集管內，4℃保存兩周內檢測。導流雜交基因芯片HPV分型試劑盒由凱普生物化學有限公司提供，能夠檢測21種基因型;PCR擴增用擴增儀由廈門安普利生物醫學有限公司提供。樣本檢測時嚴格按操作程序進行DNA提取、擴增、快速導流雜交，肉眼對樣本結果進行判讀。

1.3 統計學方法 應用SPSS10.0軟件進行統計分析，組間比較用t檢驗，率的比較采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 應用導流雜交基因芯片法檢測796例患者HPV結果796例患者標本中，HPV基因檢測陽性率為29.15%(232/796)。

2.2 導流雜交基因芯片與病理組織學檢查結果的比對隨機選取的502例患者樣本中，基因芯片技術檢測HPV基因分型陽性176例，陰性326例。陰性病例以正常細胞學及低度以下病變(慢性炎癥和CINⅠ)為主，占90.49%，高度病變(CINⅡ、CINⅢ)及宮頸癌占9.5%。陽性病例中隨著病變程度增高，HPV感染率亦逐漸升高，各組間比較差異有統計學意義(P＜0.05)。以病理組織學結果為標準，導流雜交基因芯片技術診斷宮頸癌的敏感性為96%，特異性為68.13%，陽性預測值為13.63%，陰性預測值為99.69%，結果見表1。

2.3 不同組別患者導流雜交基因芯片檢測HPV的基因型分布情況176例陽性標本中檢測出14種基因型，其中高危基因型10種，低危基因型4種。HPV基因型感染率由高到低為:HPV-16(22.7%)、HPV-58(8.5%)、HPV-52(8.5%)、HPV-18(8.0%)、HPV-33(7.4%)、CP8304(6.3%)、HPV-53(5.7%)、HPV-31(5.1%)、HPV-11(5.1%)、HPV-68(4.5%)、HPV-42(4.5%)、HPV-59(3.9%)、HPV-39(3.4%)、HPV-44(2.8%)。前七位均為高危基因型，統計顯示宮頸癌組HPV高危基因型感染率為92%，明顯高于炎癥組和CIN組，差異有統計學意義(P＜0.05);HPV-16型感染率最高且與宮頸癌病變嚴重程度正相關(P＜0.01)。

2.4 不同組別患者導流雜交基因芯片檢測HPV多重感染結果分析，各組均有多重感染的情況，隨著病變程度的加重，多重感染率越高。其中單一感染率22.3%，雙重感染率10.2%，三重感染率5.2%，四重感染率3.0%，各組感染率比較差異有統計學意義(P＜0.05)。結果見表2。

表1 502例標本依據病理組織學分組HybrMax法檢測HPV結果(例，%)

表2 不同組別患者HPV多重感染結果表(例，%)

3 討論

流行病學調查證實，高危型HPV感染是子宮頸癌和子宮頸上皮內瘤變高發的主要危險因素[3]。HPV感染的檢測已成為預防、診斷和處理宮頸病變的重要依據，因此選擇一種準確、快速、實用的HPV檢測方法很有必要。目前，采用分子雜交技術(HC-Ⅱ法)和PCR定量檢測HPV是主要的兩種篩查方法。但傳統的雜交技術操作繁雜，需時較長，易出現假陽性和假陰性，且不能判斷多重感染，從而容易造成對患者病情的錯誤評估。導流雜交基因芯片技術(HybrMax法)可彌補上述缺陷，有學者報道傳統的HC-Ⅱ法和HybrMax法的實驗結果有很高的一致性[4]。

本文實驗結果示，796例患者標本HPV感染陽性率為29.14%。所隨機選取的502例標本中，HPV感染率為35.05%。細胞學檢查正常患者標本中，HPV感染為12.06%。隨著患者宮頸病變程度的加重，HPV感染率逐漸增高，慢性炎癥組為23.69%，CINⅠ組為33.69%，CINⅡ組為59.61%，CINⅢ組為79.54%宮頸癌組為96.0%，各組間對比差異有統計學意義(P＜0.05)，證明HPV感染與CIN和宮頸癌的發生高度相關。有文獻報道，HPV感染者只有在病毒靠自身免疫力無法清除并持續感染狀態時才會引起宮頸病變。本組實驗資料宮頸癌患者的特異性為68.13%，比郭東輝等報道的資料低，它可能與本組患者年齡結構、地區差別及樣本量小有關。

HPV基因型的分布具有明顯的地區差別，在宮頸癌患者中除HPV16外，HPV45、31、33較常見，多數亞洲國家的研究提示，HPV52、58 的感染率高于 HPV45、31、33，本組數據顯示與其研究結果一致。本實驗結果中HPV45的陽性率為零，亦無HPV35和43型，符合亞洲地區高危型HPV的流行病學調查結果。宮頸上皮內瘤變組(CINⅠ、CINⅡ、CINⅢ組)中HPV52型、58型的陽性率高于HPV18型，而宮頸癌組HPV18亞型陽性率最高，提示感染HPV18型的患者可能更易致癌。近來有學者發現許多患者存在HPV混合性感染，但混合性感染的類型、作用以及對致病能力的影響尚無確切定論[5]。本文實驗結果統計發現，高級別CIN病變患者中有較高的混合性感染，主要為HPV16/18型與31/33型的混合。176例HPV陽性患者標本中，18.4%為混合性感染，主要分布在宮頸上皮內瘤變和宮頸癌組，且與病變嚴重程度成正比;混合性感染與單一感染相比，兩者宮頸上皮內病變發生率差異有統計學意義(P＜0.05)，說明多重HPV病毒亞型的混合性感染對宮頸慢性炎癥、CIN和宮頸癌的發生與發展可能有累加和促進作用。

綜上所述，采用導流雜交基因芯片技術對HPV感染者進行分型檢測，并結合細胞學的檢查，對宮頸癌的早期預防和治療意義重大，也可作為無臨床癥狀HPV感染者的療效觀察和隨訪檢查手段。

[1]郎景和.迎接子宮頸癌預防的全球挑戰與機遇.中華婦產科雜志，2002，37(3):129-131.

[2]陶萍萍，卞梅璐，歐華，等.導流雜交基因芯片技術在人乳頭狀瘤病毒檢測中應用的研究.中華婦產科雜志，2006，41(1):43-47.

[3]陳占國，周武，許張曄，等.導流雜交方法檢測人乳頭狀瘤病毒分型的臨床應用 .中華醫院感染學雜志，2008，18(9):1345-1348.

[4]烏蘭娜，吳瑞芳，周艷秋，等.人乳頭瘤病毒基因亞型與宮頸病變的關系.中國婦產科臨床雜志，2005，6:346-350.

[5]薛耀華，何雪葵，張建明，等.高危型人乳頭瘤病毒檢測及其臨床意義.廣東醫學，2005，26(2):178-179.